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目的:分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)和内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs),应用BMSCs联合不同比例EPCs与脱细胞牛心包体外构建具有血管网络化的工程化心肌样组织,并将联合构建的各组工程化心肌样组织植入裸鼠体内,检测微血管网络的形成。论证联合应用大鼠BMSCs和EPCs体外构建具有血管化网络的工程化心肌样组织的可行性,及植入体内后生成的新生血管网络功能的有效性,并探讨BMSCs/EPCs联合应用的促进血管网络化形成的最佳比例。方法:第一部分:分离、培养BMSCs,经流式对其进行鉴定。应用Ang II将BMSCs向心肌细胞定向诱导分化,对照组未添加诱导剂,采用MTT法检测各组细胞增殖曲线,并通过与对照组的对比计算不同浓度诱导组的细胞增殖抑制率。采用免疫荧光法检测各诱导组及对照组第1、4周心肌特异蛋白c Tn T、β-MHC的表达,并计算细胞转化率。RT-PCR检测不同浓度Ang II诱导组细胞培养4周时表达心肌早期转录因子GATA-4、Nkx2-5的情况。第二部分:分离、培养EPCs,通过免疫荧光法检测细胞表型v WF、FLK-1、CD34、CD133的表达,鉴定所获细胞为EPCs。用去污剂-酶消化法对新鲜牛心包进行脱细胞处理,并通过HE染色、SEM对其脱细胞前后的形态学及表面情况变化进行观察,计算脱细胞效率。将Ang II诱导培养4周的BMSCs,联合第1代EPCs与脱细胞牛心包生物支架材料进行体外复合培养,HE染色、SEM观察细胞在脱细胞牛心包上的形态及黏附生长情况。然后将体外构建的细胞/支架材料移植于裸鼠背部皮袋内,术后1、4周手术寻回植体,行HE染色、免疫组织化学染色及RT-PCR对微血管及心肌特异蛋白、基因进行检测,并观察构建的工程化心肌内部血管网络组织形成情况。结果:第一部分:原代培养的BMSCs 5~6天细胞开始成簇生长,形态为长梭形及多角形,呈旋涡状排列。12~14天细胞长成单层。流式检测细胞CD29表达阳性,CD45表达阴性。Ang II各诱导组间的细胞增殖曲线相似,0.05μmol/L组细胞增殖抑制率于第5天出现负值,与其他组有显著性意义(P<0.05)。第5,7天0.1μmol/L组细胞增殖抑制率明显低于0.2,0.5μmol/L组(P<0.05)。各诱导组的BMSCs均可表达c Tn T、β-MHC。诱导1周,0.5μmol/L组c Tn T、β-MHC蛋白阳性表达率明显高于0.05μmol/L组(P<0.05)。诱导4周,0.1μmol/L组与0.2μmol/L组两种蛋白阳性表达率均相似(P>0.05)。对照组于1,4周表达均为阴性。诱导4周,经RT-PCR检测各诱导组BMSCs均可表达转录因子GATA-4、Nkx2.5,对照组表达阴性。第二部分:原代EPCs培养至7天左右逐渐出现贴壁细胞,第18天细胞融合可达80%,传代后子代细胞单层生长,铺路石样排列,增殖力旺盛。第1代细胞经免疫荧光化学染色检测v WF、FLK-1及CD34、CD133均为阳性。新鲜的牛心包经去污剂-酶联合四步法脱细胞处理和交联剂京尼平溶液固定后,HE染色观察脱细胞处理的效率接近100%。SEM检测其超微结构:脱细胞处理后的牛心包表明无细胞残留且表面排列杂乱,放大后可见有2μm小孔。新鲜牛心包表明覆盖有排列致密的细胞层。三组细胞在处理后牛心包支架材料上培养,随着培养时间的延长,细胞数量逐步增加,经SEM观察发现三组细胞在材料上黏附良好。将细胞/支架材料植入裸鼠后,伤口无红肿、渗液,于第一周时I期愈合。1周各植入组植入物取回后发现大小无明显变化,呈深蓝色,质地略硬,未见明显包膜。HE染色结果示:术后4周,各组植入物取回后颜色深蓝色,各组植入物表面有明显血管长入,且支架材料的周边润滑圆顿。BMSCs/EPCs组支架材料血管长入较BMSCs组及EPCs组明显,且周围血管丰富;BMSCs/EPCs的比例对血管的生成有一定影响,最佳比例为80:20。结论:(1)体外可以经大鼠骨髓分离、培养获得BMSCs和EPCs。(2)经AngⅡ诱导的BMSCs表达心肌特异蛋白c Tn T、β-MHC及转录因子GATA-4、Nkx2.5,且诱导分化适宜浓度为0.1μmol/L。(3)去污剂-酶联合四步法脱细胞处理牛心包,去细胞率可达100%,BMSCs/EPCs可与其良好粘附,可以成为构建工程化心肌的良好支架。(4)BMSCs/EPCs是构建心肌/血管组织工程的种子细胞,可在大鼠体内形成组织工程化心肌,并且可以促进工程化心肌新生血管网络的形成。证实了构建的混合细胞/脱细胞牛心包是一种良好的工程化心肌组织材料。