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生殖细胞在胚胎发育的早期与体细胞分离,通过分化产生配子,将遗传信息传递给下一代,因此,生殖细胞是种族延续的基础。Dead end(Dnd)是一种存在于多种脊椎动物生殖细胞特异表达的RNA结合蛋白。大量研究表明,Dnd蛋白在生殖细胞发生、发育过程中具有重要作用,并且在不同物种中的作用存在一定差异。在斑马鱼,Dnd表达于胚胎发育早期的所有细胞,在成体,Dnd特异性表达于生殖细胞,敲降dnd不影响原始生殖细胞(Primordial germ cell,PGC)的特化、形成,但其不能迁移至性腺原基,最后发生凋亡。在青鳉,Dnd表达于胚胎发育早期的少数细胞,在成体,Dnd特异性表达于生殖细胞,敲降dnd可导致PGC前体细胞不能形成,过表达则会导致PGC数量的增加。另一方面,在人、小鼠、鸡等的研究表明,在胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)过表达生殖细胞标志基因如vasa、dazl,可诱导生殖样细胞的形成。罗非鱼隶属于鲈形目(Perciformes)鲡鱼科(Cichlidae),具有抗逆性强、繁殖周期短(14天)、生长快等特点,是世界范围内水产养殖的重要经济鱼类。本实验室前期研究结果显示,罗非鱼(在本研究中,如未特殊说明均指尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus))dnd特异性表达于成体性腺,CRISPR/Cas9基因敲除的嵌合体F0代性腺生殖细胞减少,表明Dnd在生殖细胞中具有重要角色。然而,罗非鱼dnd在胚胎发育时期表达模式如何,其表达调控如何,尚不清楚。此外,在ESCs中过表达dnd是否能诱导生殖样细胞的发生,值得研究。鉴于此,本研究以罗非鱼为对象,通过原位杂交、免疫组化以及启动子活性分析研究dnd的表达及其调控,同时通过过表达探讨其在生殖细胞诱导发生过程中的生物学作用,结果如下:1.dnd在不同组织和胚胎发育时期的表达模式与实验室前期结果一致,在成体组织中,dnd特异性表达于卵巢与精巢的生殖细胞。在卵巢中,dnd高表达于不同时相的卵母细胞,在精巢中,其高表达于不同阶段的生精细胞。在胚胎发育早期,从受精后至原肠胚期,均可见dnd的表达。在囊胚期,免疫组化检测发现,与Vasa表达模式一致,Dnd表达于所有细胞。该结果类似于斑马鱼,但不同于青鳉。2 dnd表达调控序列及其活性2.1 5’端1.2 kb序列转基因报告载体构建及其活性RT-PCR检测不同细胞系内源性dnd的表达,结果显示,罗非鱼胚胎干细胞系(TES1)、青鳉精原干细胞系(SG3)可见其明显表达,而罗非鱼间质干细胞系(TSL)、南方鲇卵巢颗粒细胞系(SCO)未见其表达。分离克隆了罗非鱼dnd ATG上游从-1200至-1长度为1.2 kb的DNA序列,并构建了转基因报告载体pT2AL-Ondnd1.2-GFP,将其转染上述4种类型细胞,即TES1、TSL、SG3、SCO,48 h后均可见明显绿色荧光,表明pT2AL-Ondnd1.2-GFP不能监测细胞内源性dnd的表达。2.2含3’UTR的5’端1.2 kb序列转基因报告载体构建及其活性已有研究表明,生殖细胞特异基因如vasa、nanos的3’UTR能使报告基因在生殖细胞中特异表达。此外,在小鼠中研究发现Dazl 3’UTR具有稳定Dazl表达的功能。由此,我们分离了罗非鱼dnd的3’端UTR长度为1500 bp的序列,并将其克隆至pT2AL-Ondnd1.2-GFP的GFP终止子下游,命名为pT2AL-Ondnd1.2-GFP-3’UTR;然后转染TES1、TSL及SG3,结果显示,相比于不含3’UTR的pT2ALOndnd1.2-GFP,其绿色荧光显著增强。从而表明,罗非鱼dnd的3’UTR能明显增强mRNA稳定性,但与pT2AL-Ondnd1.2-GFP一样,pT2AL-Ondnd1.2-GFP-3’UTR不能监测细胞内源性dnd的表达。2.3 5’端1.3 kb序列转基因报告载体构建及其活性分离克隆了罗非鱼dnd 5’端从-1200至+100长度为1.3 kb的DNA序列,并构建了其转基因报告载体pT2AL-Ondnd1.3-GFP;分别转染TES1、TSL及SG3,转染48 h后,结果未见任何荧光蛋白的表达;RT-PCR检测pT2AL-Ondnd1.3-GFP转染细胞48 h后的mRNA水平,结果显示,与pT2AL-Ondnd1.2-GFP一样,pT2ALOndnd1.3-GFP转染细胞后能够有效转录,测序结果进一步验证了其序列及GFP开放阅读框的正确性。从而表明,dnd 5’端从+1至+100的DNA序列参与了dnd的转录后水平调控。2.4含3’UTR的5’端1.3 kb序列转基因报告载体构建及其活性将dnd的3’端UTR序列1500 bp克隆至pT2AL-Ondnd1.3-GFP的GFP终止密码子下游,命名为pT2AL-Ondnd1.3-GFP-3’UTR,然后转染TES1、TSL及SG3,结果显示,TES1、SG3能检测到明显荧光,而转染TSL未见明显荧光。提示,3’UTR与+1至+100的DNA序列共同调控了dnd在生殖细胞的特异性表达。3不同因素对dnd的转录调控3.1启动子区序列荧光素酶报告载体构建及其转录活性分别克隆了罗非鱼dnd ATG上游长度为1.2 kb、1.8 kb的DNA序列,并构建了其荧光素酶报告载体,分别命名为pOndnd-1200和pOndnd-1884luc。两者转染TES1细胞,荧光素酶活性检测结果显示,相比于对照组,pOndnd-1200luc和pOndnd-1884luc均具有较强的荧光素酶活性(p<0.05),并且pOndnd-1884luc活性明显高于pOndnd-1200luc,表明-1800至-1200之间具有正向调控序列。3.2 Pou5f3、Sox2的负向调控用罗非鱼Pou5f3、sox2的真核表达载体pcDNA3.1-Pou5f3、pcDNA3.1-sox2与pOndnd-1884luc共转TES1,48 h后荧光素酶活性检测结果显示,Pou5f3和Sox2均能显著降低荧光素酶活性(p<0.05),表明Pou5f3和Sox2可负向调控dnd的表达。3.3视黄酸(Retinoic Acid,RA)的负向调控pOndnd-1884luc转染TES1,8 h后再分别用100 nM、1μM、5μM RA处理72h,结果显示,与对照组相比,RA诱导细胞其荧光素酶活性降低(p<0.05),从而表明,RA可负向调控dnd的表达。3.4雌激素(E2)的负向调控pOndnd-1884luc转染TES1,同时用罗非鱼雌激素受体的真核表达载体pBINDERα-LBD、pBIND-ERβ1-LBD和pBIND-ERβ2-LBD共转,并加入10μM E2处理。荧光素酶活性检测结果显示,E2能显著降低荧光素酶活性(p<0.05),表明E2也可负向调控dnd的表达。4.Dnd在生殖细胞诱导发生过程中的作用4.1过表达载体构建从罗非鱼性腺组织克隆dnd的开放阅读框序列,并成功并将其构建到由CMV驱动的真核表达载体中,命名为pCMV-Ondnd-Dsred。4.2 pCMV-Ondnd-Dsred在TES1中的表达pCMV-Ondnd-Dsred转染TES1,7天后50%以上的细胞均可见明显的红色荧光。4.3转染细胞生殖相关基因的表达pCMV-Ondnd-Dsred转染TES1,7天后RT-PCR检测结果显示,早期生殖细胞标志基因blimp1可见明显表达,提示Dnd在生殖细胞诱导生成过程中可能具有一定的作用。