论文部分内容阅读
利福平作为一种一线抗结核药物已在临床上广泛的应用。我们先前的研究显示,利福平可以诱导胆汁淤积适应性模型,但有报道表明利福平在多次处理大鼠及分离灌注大鼠肝脏的系统中介导胆流增加,这些结果提示利福平可能在胆流消弱的生理和病理状态下产生有益的作用；然而其利胆的机制是未知的。本文在体内条件下研究利福平介导胆流主要组分变化的基础上,从肝脏质膜转运体蛋白的表达和定位、胆流中利福平的含量以及肝内胆管系统在利胆中的作用等不同途径,初步探讨了利福平介导大鼠胆流变化的分子机制。一. 利福平多次灌胃处理大鼠介导的胆流变化及其机制探讨分别给予SD大鼠利福平(50 mg/kg·d,100 mg/kg·d,250 mg/kg·d)灌胃1天、3天和7天。末次给药24 h后,总胆管插管收集胆汁1h,取血清和肝脏组织用于后续试验。结果显示,中、高剂量组利福平灌胃1、3、7天后,胆流显著增加(P<0.05),低剂量组只有灌胃7天后胆流显著增加(P<0.05)；胆流中总胆盐和GSH的输出在各剂量组之间无明显差异,碳酸氢盐输出中、高剂量组在各时间点显著高于对照组(P<0.01),低剂量组在灌胃7天后碳酸氢盐输出显著增加(P<0.01),碳酸氢盐输出的增加提示其作为利胆的一个重要因素。血清学检测发现,在各时间点高剂量组ALT显著增高(P<0.05)；3天时高剂量组ALP显著增高(P<0.05),7天时中、高剂量组ALP显著增高(P<0.01)；在各时间点高剂量组TBA显著增高(P<0.01),在3、7天时中剂量组TBA显著增高(P<0.05)；各组ALT无显著差异。为了探讨利福平多次处理大鼠介导的胆流变化的机制,选择研究中剂量组利福平(100 mg/kg·d)引起的大鼠肝脏主要输出转运体的变化。Real-time PCR结果显示,胆汁酸输出泵(Bsep)和阴离子交换蛋白2(AE2)在不同处理时间组的转录水平无显著差异,7天组的多药抵抗相关蛋白2(Mrp2)转录水平显著高于其他时间组(P<0.05)。Western blot结果显示,Mrp2在不同处理时间组的蛋白水平无显著差异,处理组的Bsep和AE2蛋白水平显著高于对照组(P<0.05)。免疫荧光结果显示,Bsep, Mrp2口AE2主要定位在肝细胞质膜。提示肝脏小管侧输出转运体AE2在利福平多次处理大鼠介导胆流变化过程中具有重要作用。二. 利福平急性静脉灌注大鼠介导的胆流变化及其机制探讨大鼠髂静脉插管后,给予不同剂量的利福平(0.5,1,2.5,5 and 20 mg/ml)连续灌注(1.5 ml/h),总胆管插管后收集胆汁用于后续试验。结果显示,胆流在0.5 mg/ml灌注剂量时无显著变化,胆流在1-5 mg/ml灌注剂量时显著增多(P<0.05),在20 mg/ml灌注剂量时显著降低(P<0.05)。胆汁成分分析显示,在0.5 mg/ml灌注剂量时成分无显著变化,在1-5 mg/ml灌注剂量时碳酸氢盐输出量显著增加,在20 mg/ml灌注剂量时总胆盐输出量显著下降(P<0.01)。高效液相色谱结果显示,随着利福平灌注剂量的增加,胆汁中利福平的含量也递增,但是与胆流的增加无相关性,提示胆汁中利福平的含量并不是利胆的因素。由于单次给予1 mg/ml剂量的利福平产生最大的利胆效果,我们选取此剂量作为随后研究的最佳剂量。为了探讨利胆相关机制是否包括胆肝循环,我们对大鼠门静脉插管后,单次分别灌注利福平、牛磺胆酸(介导利胆但不参与胆肝循环的阴性对照)和熊去氧胆酸(介导利胆并参与胆肝循环的阳性对照)。结果显示,牛磺胆酸单次给药后20分钟胆流率显著升高,30分钟后胆流率降低到对照水平；而熊去氧胆酸单次给药后20分钟胆流率显著升高,胆流率达到最大后开始下降,但是在30至40分钟时有一个明显的利胆延长的效果；对比之下,利福平的胆流率曲线的趋势与牛磺胆酸相同,并没有产生延长的利胆效果。以上结果表明利福平并不是通过胆肝循环介导碳酸氢盐的利胆。为了进一步探讨利福平对胆流的影响,我们实施了胆管逆行灌注实验。大鼠髂静脉和总胆管插管后,平衡10分钟,髂静脉连续灌注1 mg/ml剂量的利福平(1.5ml/h),总胆管逆行灌注0.2 ml (0.5 mmol/1)的AE2抑制剂4,4’-diisothiocyanatostilbene-2,2’-disulfonic acid (DIDS)后夹闭总胆管,20分钟后打开总胆管收集胆汁。结果显示,胆管逆行给予DIDS后,增加的胆流显著降低(P<0.01),增加碳酸氢盐输出也显著降低(P<0.01)；提示胆管上皮细胞AE2活性的增加是利福平介导胆流变化的重要机制之本研究结论如下：(1)利福平处理引起大鼠的胆流增加；胆流中增加的碳酸氢盐的输出是利福平所致利胆主要因素；(2)利福平引起的利胆与胆汁中利福平的含量无关；(3)利福平不是通过胆肝循环介导的利胆；(4)DIDS阻断AE2活性后可以大部分阻断利福平介导的胆流和碳酸氢盐输出,说明胆管细胞AE2的活性的增加是利胆的机制之一