Cd2+单克隆抗体的制备及其免疫分析方法的研究

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近年来,我国经济快速稳步发展,人民的生活水平有了显著的提高。然而在此过程中,人类也付出了十分惨重的代价。在世界范围内,尤其在我国,各种重金属如汞、镉、铅、铬等已经对人类赖以生存和发展的自然环境造成了严重的污染,同时也给广大人民群众的身体健康带来了极大的威胁。镉是一种高污染、高环境风险的重金属,它是一种对环境有持续污染的物质,可以通过生物富集作用和食物链进入人体,生物半衰期长达10~30年,容易累积于人体的肾脏、肝脏、骨骼等处,高浓度的镉对人体的脏器功能有很大的损害。重金属离子的传统测定方法存在一些不足之处,如操作复杂费时、检测成本高昂、不便进行现场测定等。因此,建立灵敏、快速、简便、成本较低和可用于现场的方法来检测环境中的重金属离子是非常有意义的。与重金属传统的测定方法相比,重金属免疫学检测技术具备检出限低、选择性高、检测快速、操作简便节时、成本低廉、可进行现场测定等优点。重金属免疫学检测方法主要有竞争酶联免疫吸附分析方法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)、KinExA免疫检测方法、荧光偏振免疫检测方法(Fluorescence Polarization Immunoassay,FPIA)和胶体金免疫层析法(Colloidal Gold Immunochromatography Assay,CGICA)等。本论文建立了Cd2+间接竞争ELISA法及胶体金免疫层析法,主要内容如下:第一章:本章介绍了重金属的定义、分布情况、污染危害及防治等;对重金属免疫分析技术和ELISA法做了简述;对胶体金免疫层析快速检测技术的原理及其研究进展进行了概述,在此基础上阐述了本论文的研究目的和主要内容。第二章:制备Cd2+单克隆抗体并建立测定Cd2+的间接竞争ELISA法。选择双功能螯合剂1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N,N,N’,N’-四乙酸(ITCBE),分别与载体蛋白(牛血清白蛋白,BSA;卵清蛋白,OVA)和镉离子连接,制备出免疫原(Cd-ITCBE-BSA)和包被抗原(Cd-ITCBE-OVA),采用免疫原免疫BALB/C小鼠,利用细胞融合杂交瘤技术制备出针对镉离子的单克隆抗体。通过优化实验条件,Cd-EDTA浓度范围在1-1000 ng/mL内建立快速检测水样中镉离子的间接竞争ELISA方法。该方法的IC50为13.67 ng/mL,检测限为0.48 ng/mL。该抗体与汞离子的螯合物的交叉反应率为79.29%,除此之外,与Zn2+、Cr3+、Pb2+、Cu2+、Ni2+、Al3+、Co2+、Fe3+、Mg2+、Ca2+和Ba2+均无交叉反应。超纯水、自来水和湖水样品中镉的加标回收率为87.78%~103.3%,相对标准差为1.60%~11.41%。结果表明,建立的间接竞争ELISA法灵敏、快速,可用于水样中Cd2+的检测。第二章:研制快速检测水样中镉离子的胶体金免疫层析试剂条。采用竞争法,将胶体金标记的Cd2+单克隆抗体包被在金标垫上,然后用包被抗原Cd-ITCBE-OVA和羊抗小鼠IgG在硝酸纤维素膜上依次划线,分别作为检测线(T线)和质控线(C线),3~5 min后根据条带显色情况判断结果。实验对试剂条进行灵敏度、特异性和准确度验证,并检测加标水样。通过优化实验条件,在羊抗小鼠IgG稀释倍数为200倍,包被抗原浓度为0.25 mg/mL时,试剂条对镉离子的检出限为100 ng/mL。除与汞离子的螯合物有交叉反应外,与Zn2+、Cr3+、Pb2+、Cu2+、Ni2+、Al3+、Co2+、Fe3+、Mg2+、Ca2+和Ba2+均无交叉反应。对湖水的加标检测结果与ELISA的检测结果一致。结果表明,制备的胶体金免疫层析试剂条快速简便、稳定可靠,可作为现场检测水样中重金属镉离子的有效手段。
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