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支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)和芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸和色氛酸)是褐飞虱体内不能自身合成的两类非常重要的氨基酸,本课题组之前的研究结果表明,褐飞虱与其体内共生菌协同合成缬氛酸、亮氨酸、异亮氛酸苯、丙氨酸和酪氛酸。共生菌独立合成色氨酸。本文分析了褐飞虱的转录组中芳香族、支链氨基酸代谢相关基因,采用RT-PCR、RACE技术获得了两类氨基酸合成过程中两个关键酶转氨酶和脱氢酶基因的cDNA全长;利用RNAi技术,将基因沉默后分析两种酶基因的功能。研究结果总结如下。1.褐飞虱芳香族氨基酸、支链氛基酸合成基因的克隆及结构分析本章基于褐飞虱转录组数据库,筛选出了支链氨基酸、芳香族氛基酸合成相关的49个基因片段,经拼接后得到36条片段。采用RT-PCR技术,得到了 19条片段。进一步结合RACE技术对克隆验证正确的片段获得完整的3’端和5’端,共得到完整的基因编码序列8条。缺失5’端5条,缺失3’端3条,两端缺失序列3条。分析了这些片段的基因结构,结果显示,来自褐飞虱体内的片段其基因结构较复杂,含有多个内含子;而来自类酵母的片段其基因结构简单,最多含2-3内含子,且内含子较短。经进一步分析两类氨基酸合成途径,总结出褐飞虱对氨基酸营养需求需要其体内共生菌的参与才能正常完成其生物合成。2.褐飞虱预苯丙酸脱氢酶和支链氨基酸转氨酶基因的基因来源分析支链氨基酸转氨酶和预苯酸脱氢酶编码基因存在于类酵母和褐飞虱基因组中。为了确定支链氨基酸转氨酶和预苯酸脱氢酶的物种来源,本章进行了进化分析并测定了这两个基因在不同部位的表达,发现这两个基因均与真菌类同源序列相近,且主要在腹部表达。由于共生菌主要存在于褐飞虱腹部,胸部含有量很少,翅、足、头等部位不含共生菌。据此推测,上一章克隆的支链氨基酸转氨酶和预苯酸脱氢酶编码基因均来源于类酵母。3.RNAi技术分析支链氨基酸转氛酶和预苯酸脱氢酶功能支链氨基酸转氨酶和预苯酸脱?酶分别是支链氨基酸和苯丙氨酸合成过程中的关键酶,其编码基因NlBCAT和NlPDH具有相似的表达动态。如两种基因均在2龄和4龄表达量较低,而3龄和5龄表达量较高;而且两种基因在雌性成虫体内的表达量均高于雄虫。褐飞虱2龄初若虫喂食dsNlPDH或dsNlPDH4天后,NlPDH或NlPDH表达量极显著下降。喂食6天后,两个基因的表达量持续处于低水平。但喂食dsNlPDH或dsNlPDH6天并不显著影响若虫的存活。