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犬尿氨酸代谢途径作为L-色氨酸的重要代谢途径之一,该途径的一系列代谢中间产物与炎症和兴奋性神经传递相关,该代谢途径失调或紊乱可能导致炎症性神经系统疾病,如阿尔兹海默症、亨廷顿症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、抑郁症和精神分裂症等。同时,犬尿氨酸代谢途径在免疫抑制和肿瘤诱导耐受方面也起着至关重要的作用。抑制犬尿氨酸代谢途径中的酶,成为几种神经紊乱疾病和肿瘤治疗的新靶点。犬尿氨酸甲酰胺酶(kynurenine formamidase,KFase;EC 3.5.1.9)作为犬尿氨酸代谢途径的限速酶之一,其也有可能成为神经紊乱疾病和肿瘤治疗的新靶标。此酶的催化中心是由丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸残基组成的催化三联体构成,其抑制剂的筛选与研究,可以为相关疾病的治疗提供潜在的药物或药物的前体。本研究利用计算机模拟技术,基于果蝇KFase的晶体结构(PDB ID:4E11)构建了人KFase的三维结构模型,分析其三维空间结构特征。然后,使用分子对接方法获得酶与天然底物N-甲酰-L-犬尿氨酸(N-formyl-L-kynurenine,NFK)的复合物模型,并利用分子动力学模拟方法分析二者之间的相互作用。随后,使用虚拟筛选技术在小分子化合物数据库ZINC和PubChem中虚拟筛选抑制剂。最后,从HepG2细胞中克隆犬尿氨酸甲酰胺酶的基因,构建包含该基因的载体pTYB12重组质粒。在原核生物大肠杆菌BL21(DE3)中表达融合蛋白,并使用chitin beads纯化,纯化后的蛋白进行活性检测、酶动力学分析以及抑制剂检验。三维结构建模结果显示,构建的人KFase模型结构合理,催化中心Ser164、Asp244和His279位于活性空隙的底部,活性空隙的空间足以容纳NFK,有利于催化反应的进行。分子对接的结果显示NKF的甲酰胺基团接近活性中心的残基Ser164,残基Tyr45有可能参与了稳定底物空间构象的作用。分子动力学模拟结果显示,活性中心残基Ser164、Asp244和His279所在区域在模拟过程中结构稳定,Tyr45有较大活动范围,符合酶催化反应过程的结构需求。虚拟筛选获得了9个小分子化合物。此外,在原核生物大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了具有催化活性的人KFase。人KFase的三维结构的计算机模拟分析,以及KFase的表达与纯化,将有助于研究KFase的三维空间结构和生理生化特性。虚拟筛选的小分子抑制剂,将为KFase的抑制剂研究提供备选化合物或化合物的前体,从而为多种疾病的治疗提供新的治疗方法。此外,我们获得了具有催化活性的人KFase,为后续抑制剂的研究奠定基础。