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沙门菌(Salmonella)可以通过污染食物感染人和动物,引起多种人和动物的急性或慢性传染病,是一种在公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病原菌。在世界各地的食物中毒病例中,沙门菌引起的中毒病例占首位或第二位,严重威胁着人类的身体健康和畜牧业的健康发展。目前许多发达国家诸如美国都已建立了相对完善的沙门菌流行病学监测和耐药监控体系,流行病学数据较为丰富,同时也开展了较深入的耐药机制研究,而我国在这方面的研究还比较滞后。为了了解动物沙门菌的流行情况和药物敏感性,以及对氟苯尼考的耐药机制。本研究对临床上疑似沙门菌病的病料进行病原分离和细菌的多重PCR鉴定,选取临床分离株S101022、0605E2-H,并针对floR、 AcrB两个耐药基因,采用λ-Red同源重组法构建相应的基因缺失株,初步探讨了这两个耐药基因与氟苯尼考耐药的关系,为进一步深入研究沙门菌氟苯尼考耐药的分子机制奠定了基础。1.沙门菌的分离鉴定及耐药性分析对临床上疑似沙门菌病的病料进行病原分离和细菌的多重PCR鉴定,共分离到沙门菌61株,其中肠炎沙门菌10株,鸡白痢沙门菌12株,鼠伤寒沙门菌39株,月份分布显示,7-8月分离率最高。K-B法测定分离株对23种抗菌药物的敏感性以及部分药物的MIC结果显示,动物源沙门菌耐药性总体呈现上升趋势,所有菌株对青霉素、红霉素、万古霉素耐药,90.16%对6种及其以上抗菌药耐药。选择氟苯尼考耐药菌株扩增floR、fexA、fexB等基因,结果显示,8株携带floR,其他基因未检测到,对克隆的floR基因的核苷酸序列进行分析,与Genbank中已报道动物源性沙门菌floR基因核苷酸序列比较,发现同源性在99.3%-100%,氨基酸序列的同源性在99.2%-100%,分别在147、160、228、293位发生了氨基酸的替代。2.氟苯尼考相关耐药基因缺失株的构建及其耐药表达研究选取都柏林沙门菌S101022、鼠伤寒沙门菌0605E2-H,针对不同耐药基因floR、 AcrB,使用λ-Red同源重组法,构建6个耐药基因缺失株,PCR扩增以及突变株序列测序结果显示6个基因突变株构建成功。采用第一章中的方法测定相应缺失株的药物敏感性,其结果显示缺失株对氟苯尼考的耐药性成功丢失。细菌的生长曲线测定结果显示,双基因缺失株的生长速度略慢于野生株,其余菌株的生长速度并无明显差异。采用Q-PCR方法对floR.AcrB耐药基因的表达进行了测量,结果显示,floR缺失株无论是否氟苯尼考的选择压力下,AcrB的表达量会呈现不同程度的增加,添加CCCP后,AcrB的表达量并没有显著差异；而AcrB缺失株在CCCP的选择性压力下,floR的表达量却有了一定程度的升高,证明AcrB的表达对外界环境改变(尤其是抗生素)有着相关程度的依赖性,而正常环境下floR的表达并没有显著的差异；AcrB和floR在氟苯尼考耐药过程中的表达差异并不明显。3.HPLC法测定氟苯尼考在耐药和基因缺失株内聚集的研究采用HPLC法测定野生株S101022、0605E2-H和基因缺失株S101022△floR. S101022△AcrB.0605E2-H△f1oR、0605E2-H△AcrB摄取氟苯尼考的差异,结果显示,与floR和AcrB基因缺失株相比,耐药的野生株S101022和0605E2-H对氟苯尼考的摄取量明显较少,而在加入氟苯尼考的10 min,野生株的氟苯尼考的积聚量约是双基因缺失株的1/2。而在耐药过程中加入CCCP和PAβN(一种外排泵抑制剂),发现CCCP对△AcrB氟苯尼考的积聚量影响较大,对△floR影响并不显著,而PAβN对△AcrB氟苯尼考的积聚量影响较小,而对△floR影响及其显著,可见CCCP可能主要针对的是floR基因介导的泵出系统,而PAβN主要针对的是AcrB介导的泵出系统,两者对氟苯尼考的能量抑制存在特异性,且在氟苯尼考的耐药过程中均发挥了一定的作用。