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miRNA是近几年发现的对基因表达转录后调控的小分子RNA。目前已经鉴定鸡的miRNA大部分来源于胚胎、体节和干细胞。而对于鸡后期发育相关的miRNA鉴定和表达研究较少。每个miRNA的靶基因的个数很多,同时多个miRNA调控一个基因的表达,他们交叉在一起形成了复杂的网络调控。因此研究miRNA对基因表达调控的影响,分析其与靶基因的关系,必须在机体的整体水平进行研究。本研究对鸡下丘脑不同发育阶段(1日龄和36周龄)固始公鸡进行miRNA和mRNA高通量测序,筛选出差异表达的miRNA和mRNA,并对其表达情况和潜在功能进行分析和预测。同时采用系统生物学的方法将mRNA和miRNA表达谱进行综合分析,以期阐明miRNA对动物采食、生长发育中的调控机制。为采食和生长发育的的研究提供新的思路和有益的线索。本研究获得以下主要结果:实验一、Solexa技术构建鸡下丘脑miRNA表达谱采用solexa技术对1日龄和36周龄鸡下丘脑miRNA进行高通量测序测序,并进行生物信息分析。结果表明1日龄和36周龄组成的小RNA的片段长度主要分布在18~30个核苷酸(nt)的范围内,符合miRNA的长度特点。但是1日龄和36周龄下丘脑组织文库中miRNA长度分布存在差异,在1日龄中长度主要分布为22nt的小RNA占44.35%,其次是23nt的小RNA占26.37%,两者占总序列的70.72%,但是在36周龄中表达量最高的是23nt,占23.06%,其次是22nt的小RNA占26.37%,两者占总序列的49.43%。其他小RNA分布在36周龄和1日龄鸡中差异较大。以1日龄下丘脑组织为对照,在36周龄下丘脑中筛选到179个差异表达miRNA,其差异倍数大多集中在1-2倍。其中22个miRNA上调表达,157个miRNA下调表达。在两个文库中筛选到363个潜在新的候选miRNA,其中85个在两个文库中都有,112和166个分别在1日龄和36周龄中特异表达。179个差异显著的miRNA预测到4362个靶基因,KEGG和GO分析过程中基因大部分参与细胞代谢,和调控细胞代谢有关。实验二、下丘脑发育相关的miRNA的验证及组织时空特异性表达采用定制茎环反转录引物,利用qPCR对miR-21、miR-9、miR-92、miR-181a在下丘脑中的表达进行了定量检测,结果表明qPCR检测的这几个基因的变化倍数与高通量测序检测结果不完全相同,但变化方向一致。而miR-9、miR-181a和miR-92在鸡的同一时期不同组织部位的表达有组织特异性,不同的miRNA的在不同组织中的表达规律不一致。利用TargetScan 5.1与PicTar两种计算方法对miR-9、miR-181a和miR-92进行靶基因预测,交集靶基因有160,137和157个。miR-9靶基因在KEGG通路分析中,显著的通路有细胞骨架调控,细胞增殖和分化有关的通路(P<0.01)等5个通路(P<0.05)。miR-181a的靶基因KEGG分析结果表明,靶基因富集于神经营养因子通路、长时程增强效应通路、II型糖尿病通路、MAPK信号通路、醛固酮调节钠的重吸收、T细胞受体信号通路和卵母细胞减数分裂等与代谢有关的7个通路(P<0.05)。miR-92的靶基因主要富集在长时程增强效应通路、II型糖尿病通路和MAPK信号通路等3个通路(P<0.05)。实验三、构建鸡下丘脑mRNA数字表达谱及初步分析采用solexa技术对1日龄和36周龄鸡下丘脑mRNA进行高通量测序测序,并进行生物信息分析。结果表明在1日龄和36周龄鸡下丘脑中干净有效的tag序列的拷贝数在两个文库中分布规律相似,即随着转录本拷贝数的增多,其所包含的tag的总数和种类越来越少。拷贝数超过100的转录本,在两个文库中分别为4.81%,5.18%。超过超过80%的转录本的拷贝数在2-50个,40%的转录本的拷贝数在2-5个。以1日龄鸡下丘脑组织为对照,在36周龄中共筛差异基因有1143个,其中上调基因413个,下调基因730个,1日龄特异表达的50个,36周龄特异表达的有17个。差异基因KEGG分析表明基因富集的通路大部分与代谢和疾病有关。GO分析表明大部分靶基因与细胞代谢,和调控细胞代谢有关,相关的结果和miRNA靶基因富集的通路相似。实验四、鸡PMCH基因的克隆及生物信息学分析采用RT-PCR, 3’-RACE and 5’-RACE扩增获得PMCH基因cDNA全长803bp(登陆号:HM853641),生物信息学分析表明鸡PMCH有完整的ORF,其长度为492bp,编码163氨基酸,起始密码子ATG位于69bp和终止密码子位于558-560 bp。起始密码子前的5’非翻译区包含68bp,终止密码子后有243bp的3,非翻译区。在3,末端的polyA尾上游20bp处有加尾信号AATAAA,包括3个外显子和2个内含子。与人、小鼠、牛、黑猩猩,和大鼠的核酸相应序列同源性分别为65.95%、62.69%、65.19%、66.54%和59.62%。氨基酸序列的同源性分别为52.07%、50.30%、52.07%、50.89%和50.30%。鸡PMCH基因编码的蛋白为可溶性蛋白。编码蛋白的氨基酸序列存在pro-MCH、CSP,IL7、XPGI和low complexity sequence等5种结构域,含有8个磷酸化位点;同时在鸡PMCH的3’非翻译区预测到3个microRNA靶位点。综上所述,本研究采用新一代测序技术对鸡下丘脑不同发育阶段进行miRNA和mRNA表达谱研究,应用系统生物学的方法分析二者的关系,拓展了鸡已知miRNA的数量;同时构建了miR -9、miR -92和miR -181a的组织表达谱;克隆了鸡PMCH基因并对其的生物学功能进行生物信息分析。