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目的:探讨运用NF-κB寡脱氧核苷酸诱骗剂(NF-κB ODN Decoy)策略是否能够构建胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis,CIA)疾病过程中大鼠脾脏来源的稳定的耐受性树突状细胞(dendritic cell,DC),然后利用NF-κB ODN Decoy诱导CIA大鼠和正常大鼠脾脏来源的并负载牛Ⅱ型胶原(bovine collagen typeⅡ,BⅡC)的耐受性DC,分别对自身CIA大鼠和同种异体CIA大鼠在病程中进行体内干预试验,观察其干预效果。方法:以雌性SD大鼠为实验动物。1.第一部分:NF-κB ODN诱骗剂诱导CIA大鼠耐受性DC的构建。(1)分别提取正常大鼠和病程中CIA大鼠脾脏单个核细胞,用大鼠细胞因子GM-CSF和IL-4诱导成DC,再经NF-κB ODN Decoy诱导其耐受性。(2).SD成年大鼠左足跖皮内注射牛Ⅱ型胶原和弗氏完全佐剂1:1混合的胶原乳剂,间隔两周在尾根部皮下注射同等剂量胶原乳剂来增强免疫,形成胶原诱导性关节炎模型。(3).病程中CIA大鼠脾脏单个核细胞提取是在SD大鼠在BⅡC初次免疫后第13天,无菌切取整个脾脏(第二部分取半个脾脏,保持大鼠存活),提取单个核细胞并诱导培养成耐受性DC。(4).根据细胞来源和处理方法分为正常大鼠单纯培养DC组(正常-Control-DC)、正常大鼠Decoy诱导DC组(正常-Decoy-DC)、CIA大鼠单纯培养DC组(CIA-Control-DC)、CIA大鼠Decoy诱导DC组(CIA-Decoy-DC)、CIA大鼠脂多糖(Lipolysaccharides,LPS)刺激Decoy-DC组(CIA-LPS-Decoy-DC)和CIA大鼠LPS刺激DC组(CIA-LPS-DC)六组。(5).各组生物学性状观察:细胞形态特征观察用相差显微镜和瑞氏染色法;细胞活力评估用台盼蓝染色法;流式细胞术检测DC表面相对特异性标志OX-62表达情况来综合评估DC的纯度,检测CD80和CD86表达情况来综合评估DC的成熟状态;同种异体混合淋巴细胞反应观察其刺激T淋巴细胞增殖能力并检测细胞培养基上清液中IFN-γ和IL-10浓度,综合评价NF-κB ODN Decoy对DC成熟的抑制作用。2.第二部分:NF-κB ODN诱骗剂诱导CIA大鼠耐受性DC的应用初探。(1).利用体外实验中CIA大鼠和正常大鼠来源的Decoy DC并负载BⅡC对自身CIA大鼠和同种异体CIA大鼠进行病程中干预(BⅡC乳剂在首次免疫后第20天大鼠CIA处于病程中注射)。(2).各组实验大鼠在初次免疫后第20天经尾静脉注射经不同方法处理的DC(5×10~6个)。将实验大鼠分为空白对照组、CIA模型组、CIA大鼠BⅡC-Decoy DC实验组、正常大鼠BⅡC-Decoy DC实验组、CIA大鼠BⅡC-Decoy DC对照组和正常大鼠BⅡC-Decoy DC对照组共六组。(3).观察指标及检测:从建模开始,每周观察各组大鼠各处关节肿胀程度,并计算关节炎指数(arthritis index,AI),初次免疫第42天称重后处死大鼠,对大鼠左踝关节滑膜组织作病理检查,用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)来检测各组大鼠血清中IFN-γ、IL-10的含量。结果:1.第一部分:(1)正常-Control-DC和CIA-Control-DC组可见细胞形态不规则,周边较多毛发样突起,加LPS后细胞周边毛发样突起增多。正常-Decoy-DC和CIA-Decoy-DC组细胞形态较规则,周边毛发样突起较少,加LPS刺激后形态无明显改变。(2)在正常大鼠和CIA大鼠中,与Control-DC组比较,Decoy-DC组细胞表面共刺激分子CD80和CD86阳性表达率和平均荧光强度显著降低(p<0.05);在CIA大鼠中,与CIA-LPS-DC组对比,CIA-Decoy-DC组经LPS刺激后CD80和CD86阳性表达率与平均荧光强度未明显上调;(3)在正常大鼠和CIA大鼠中,与Control-DC相比,Decoy-DC刺激淋巴细胞增殖能力显著降低(p<0.05),使淋巴细胞IFN-γ分泌下降,IL-10分泌升高(p<0.05);在CIA大鼠中,CIA-Decoy-LPS-DC组刺激淋巴细胞增殖能力明显低于CIA-LPS-DC(p<0.05);2.第二部分:(1)与CIA模型组相比,注射NF-κB ODN Decoy处理CIA大鼠来源的和正常大鼠来源的并负载BⅡC的DC对自身CIA大鼠和同种异体CIA大鼠进行病程中干预后,其关节炎指数和滑膜组织病理评分明显降低,差异具有统计学意义(p<0.05)。(2).各组中CIA模型组大鼠血清中IFN-γ浓度水平明显高于空白对照组(p<0.01),IL-10的浓度水平明显低于空白对照组(p<0.01);注射NF-κB ODN Decoy处理并负载BⅡC的DC治疗后,BⅡC-Decoy DC实验组大鼠血清中IFN-γ浓度水平明显低于CIA模型组(p<0.01),而IL-10的水平显著高于CIA模型组(p<0.01)。结论:(1)通过DC独特形态特征及表面共刺激分子说明:从正常大鼠和CIA大鼠脾脏来源的DC在形态及特性方面无明显差别;(2)通过检测DC表面表达的CD80和CD86阳性率及平均荧光强度的相互比较说明:CIA大鼠脾脏来源的DC利用NF-κB ODN Decoy成功诱导培养了形态和表型都稳定的耐受性DC;(3)通过混合淋巴细胞反应说明CIA大鼠来源Decoy-DC刺激淋巴细胞增殖能力较低,进一步说明其具有相对不成熟的免疫表型即耐受性DC。(4)经过对各组大鼠观察四肢关节肿胀情况、关节炎指数评分和观察关节滑膜组织病理形态及评分,显示来源于病程中CIA大鼠和正常大鼠并经NF-κB ODN Decoy处理和负载BⅡC的DC分别对病程中自身CIA大鼠和同种异体CIA大鼠有良好的治疗效果,使其症状、体征、滑膜组织病理表现均得到一定程度的逆转与改善。