红霉素是一种由I型聚酮合酶催化合成的聚酮类化合物。聚酮类化合物具有结构和生物活性的多样性,因此是重要的新药开发来源之一。红霉素对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌都有一定的抑制作用,具有广谱的抗菌活性,常用于治疗皮肤软组织感染、结膜炎、咽炎和肺炎等疾病。通过对红霉素结构的改造产生了一系列红霉素衍生物,这些红霉素衍生物相对红霉素有更强的抗菌活性,对人体毒性更低以及细菌不易产生耐药性等优点。阐述红霉素生物合成机理,为设计产生更多新的聚酮类化合物,发现对人类疾病治疗更加有效的药物提供理论基础。DEBS蛋白是催化红霉素生物合成的聚酮合酶,包含三个亚基蛋白,每个亚基均包含两模块。目前DEBS蛋白亚基在大肠杆菌异源表达量低,只有部分截断的结构域的精细结构,尚未获得模块、亚基和全复合物的整体结构的阐释。本研究针对异源表达大蛋白,一般产量较低这一问题,以红霉素合成大机器为研究目标,提高了DEBS蛋白中DEBS2亚基的异源表达水平,同时建立了DEBS3亚基的体外表达纯化体系,获得了高纯度的分子量320k Da的DEBS3蛋白;证明了优化目的基因起始部分序列对大分子量的DEBS2（374k Da）蛋白表达量的提高具有明显的作用,同时对DEBS3蛋白的结构进行初步探索。以异源表达量低的DEBS2为目标,选择其编码区的起始区域的11个氨基酸33bp,设计其简并引物,氨基酸序列不变,通过简并引物和PCR方式随机改变密码子,再通过PCR产物构建到表达载体上,成功筛选到相对出发质粒高表达目的蛋白DEBS2的简并质粒,使得DEBS2蛋白表达量得到显著提高。构建了DEBS3的n Flagc His标签的表达载体,优化了DEBS3蛋白的表达条件:分子伴侣共表达,诱导剂浓度筛选和培养基筛选,最终获得DEBS3蛋白的最佳表达条件:在TB培养基中,大肠杆菌BAP1作为宿主菌,分子伴侣pGro7质粒共表达,终浓度100μM/L的IPTG诱导蛋白过表达,得到了蛋白的可溶性高表达;通过Ni柱亲和层析、Q柱离子交换、Flag柱亲和层析和凝胶过滤层析,对DEBS3蛋白进行了有效的分离纯化,得到了高纯度的DEBS3蛋白;通过负染电镜对DEBS3蛋白结构进行了观察,优化了DEBS3蛋白的缓冲液,初步获得了电镜可观察的蛋白颗粒。目前尚未见红霉素单模块蛋白的结构报道,因此本研究也成功构建了单模块M2、M3、M4、M5和M6的大肠杆菌表达载体,并得到了高纯度的M3蛋白。本研究通过优化目的基因起始序列,成功获得374k Da的高表达DEBS2蛋白的大肠杆菌菌株,使DEBS2蛋白在大肠杆菌中表达量由SDS-PAGE胶图中几乎不可见到可纯化;建立了巨大蛋白红霉素合酶蛋白亚基体外表达和纯化流程,探索了DEBS3蛋白的负染结构。成功获得大肠杆菌中表达的高纯度大蛋白DEBS3,并对其结构进行了探索,为下一步对DEBS2和DEBS3蛋白及红霉素合酶结构的解析奠定基础,并通过基因工程或蛋白质工程等手段定向改造红霉素结构提供理论基础。