缺血再灌注损伤(Ischemia-reperfusion injury)仍然是休克、器官移植、心肌梗死和脑梗死溶栓或介入治疗的瓶颈。其发生机制尚未完全清楚,目前认为主要包括:氧化应激、钙超载、代谢障碍和炎症反应等引起的血管内皮细胞损伤和血管舒缩因子失衡及微血管栓塞。临床资料显示,抗氧化剂维生素C、钙拮抗剂硝苯地平等治疗未能明显改善再灌注损伤。因此,开发治疗缺血再灌注损伤的多靶点药物,具有重要的临床价值和意义。课题组前期研究证实,中药巴戟天的寡糖复合物,降低冠状动脉缺血再灌注大鼠心肌梗死体积,促进大鼠心肌缺血再灌注后血管新生,促进鸡胚尿囊膜血管新生。但巴戟天寡糖复合物的具体有效成分是什么,不同聚合度的寡糖单体抑制缺血再灌注损伤的活性有无差异,作用机制和作用靶点尚且不知。血管内皮细胞是缺血再灌注损伤首先累及的细胞,其受损导致血管通透性增加,血管屏障功能受损,以及微血管栓塞,进一步加重循环障碍,造成组织器官功能障碍。同时血管内皮细胞自身分泌的多种细胞因子参与缺血再灌注损伤,在缺血再灌注损伤发生机制中占据重要的地位。因此,本研究采用人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)建立体外缺氧/复氧损伤模型,筛选对缺氧/复氧损伤内皮细胞起保护作用的巴戟天寡糖单体,鉴定巴戟天寡糖单体的化学结构与活性;全转录本基因芯片检测差异表达基因,信号通路富集分析菊粉五聚糖(Inulin 5)保护缺氧/复氧损伤人脐静脉内皮细胞的分子机制;磁珠偶联Inulin 5,以捕获人脐静脉内皮细胞内靶蛋白,并对捕获蛋白进行质谱鉴定,以期探索Inulin 5保护缺氧/复氧损伤HUVECs的作用靶点和分子机制,为防治缺血再灌注损伤提供新的对策和药物作用靶点。材料与方法1.菊粉五聚糖(Inulin 5)的提取、分离、结构与活性鉴定70%乙醇提取碾碎的中药巴戟天根中成分,在其水溶性馏分中获得巴戟天寡糖。通过基质飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)分析巴戟天寡糖主要组成。巴戟天寡糖经乙酰化处理后,通过硅胶柱色谱法收集级分,分离乙酰化单体。通过MALDI TOF-MS、1H-核磁共振(Nuclear magnetic resonance,1H-NMR)和同核化学位移相关谱(Correlation spectroscopy,COSY)鉴定乙酰化单体的结构。各乙酰化单体经脱乙酰化后,加入Dowex 50W×2H树脂过滤,并经Bio-Gel P-2凝胶过滤柱脱盐,冷冻干燥,获得Inulin 4-7单体。DPPH氮自由基清除试验筛选各单体抗氧化活性,细胞计数试剂盒-8(Cell count kit-8,CCK-8)筛选各单体保护缺氧/复氧损伤HUVECs活性。2.Inulin 5保护缺氧/复氧损伤人脐静脉内皮细胞的分子机制Affymetrix人全转录组基因芯片分析差异表达基因;KEGG数据库富集分析差异表达基因的信号传导通路;RT-qPCR验证基因芯片影响细胞周期相关细胞周期蛋白E2(Cyclin E2,CCNE2)、细胞周期蛋白依赖性激酶6(Cyclin-dependent kinases 6,CDK6)、肿瘤蛋白 p53(Tumor protein 53,p53)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 1A(Cyclin-dependent kinasesin inhibitor 1A,CDKN1A/p21)的mRNA表达;Western blot分析PI3K-AKT-eNOS信号通路蛋白表达;流式细胞周期试验和小管形成试验检测PI3K抑制剂对Inulin 5对缺氧/复氧损伤HUVECs细胞周期和小管形成的影响。3.Inulin 5偶联磁珠捕获人脐静脉内皮细胞靶蛋白及鉴定激光共聚焦显微镜检测,FITC偶联Inulin 5在HUVECs细胞内定位情况;Inulin 5偶联磁珠捕获HUVECs的靶蛋白,蛋白质谱鉴定。siRNA敲低Annexin A2,CCK8 和 RT-qPCR 检测 Inulin 5 对 H/R HUVECs 生长和 CDK6 的影响。表达纯化Annexin A2蛋白,Biacore T200表面等离子共振分析Inulin 5与Annexin A2亲和力;分子对接分析Inulin 5与Annexin A2和Annexin A2-S100A10的结合位点。实验结果1.Inulin 5的提取、分离、结构与活性鉴定(1)MALDI-TOF-MS测定巴戟天寡糖复合物由聚合度为3-13的低聚糖组成。(2)1H-NMR和COSY鉴定巴戟天寡糖是菊粉低聚糖,结构为α-D-Glcp-(1→2)-[β-D-Fruf-(2→1)-β-D-Fruf](n)-(2→1)-beta-D-Fruf。(3)Inulins 4-7剂量依赖性地清除氮自由基,随聚合度增加清除氮自由基能力减弱。(4)Inulin 4和Inulin 5,剂量依赖性地促进缺氧/复氧损伤HUVECs细胞存活和增殖,Inulin 4和Inulin 5的EC50值分别为12.65μM(95%置信区间:7.14-22.43μM,n=5)和 29.97μM(95%置信区间:9.15-98.14μM,n=5),Inulin 5还可显著促进常氧条件下HUVECs的增殖。2.Inulin 5保护缺氧/复氧损伤人脐静脉内皮细胞的分子机制(1)Affymetrix HTA2.0(n=3)全转录本基因芯片结果显示,H/R损伤后表达下降,而Inulin 5显著增加的基因有330个(差异表达变化倍数>1.5,P<0.05,误差率<10%,n=3)。(2)KEGG信号通路富集分析,Inulin 5处理引起的差异表达基因主要富集于DNA复制,错配修复,同源重组,核苷酸切除修复,细胞周期,卵母细胞减数分裂,黄体酮介导的卵母细胞减数分裂,细胞凋亡,癌症,P53,神经营养因子信号通路,泛素介导的蛋白水解,血管平滑肌舒张,长时程增强,胰岛素信号通路,以及丝裂酶原活化的蛋白激酶(MAPK),雷帕霉素哺乳动物靶标(mTOR),磷脂酰肌醇二磷酸和Wnt,NOD,RIG信号传导通路。(3)缺氧1小时,复氧3小时HUVECs细胞内,Inulin 5上调细胞周期相关 CCNE2 和 CDK6 的 mRNA 表达,下调 p53 和 p21 的 mRNA 表达(P<0.01,n=6)。(4)在缺氧1小时,复氧0.5,1.5,3和6小时HUVECs内,Inulin5激活PI3K-Akt-eNOS信号传导通路,显著促进p-Akt以及p-eNOS和eNOS的蛋白表达(P<0.05,n=3),PI3K抑制剂LY294002可抑制这一作用。(5)Inulin 5促进正常和缺氧1小时,复氧18小时H/RHUVECs细胞周期转变,Inulin 5增加了 S和G2/M期细胞百分比(P<0.05,n=3),PI3K抑制剂LY294002抑制Inulin 5的促细胞周期转换作用。(6)Inulin 5促进正常和缺氧1小时,复氧18小时H/R HUVECs细胞小管形成(P<0.01,n=3),PI3K抑制剂LY294002抑制Inulin 5的促小管形成作用。3.磁珠偶联Inulin 5捕获HUVECs内的靶蛋白及鉴定(1)激光共聚焦显微镜检测显示,FITC-Inulin5在HUVECs内的定位主要在细胞膜和细胞浆。(2)磁珠偶联Inulin5捕获HUVECs内的靶蛋白,蛋白质质谱鉴定35-40KD间条带最可能为钙调膜磷脂结合蛋白蛋白Annexin A2,40-55KD间条带最可能为延伸因子EF-1a,此外还有肌动蛋白(actin)和微管蛋白(tubulin)等。(3)SiRNA敲低Annexin A2,缺氧1小时,复氧42小时HUVECs细胞内,CCK8检测显示Inulin5失去保护HUVECs作用(P>0.05,n=6);SiRNA敲低Annexin A2,缺氧1小时,复氧2小时HUVECs细胞内,RT-qPCR检测显示Inulin5失去促CDK6表达作用(P>0.05,n=9)。(4)表达纯化Annexin A2蛋白,表面等离子共振分析Inulin5与Annexin A2之间存在亲和力,ka=27.12,KD=37.5μM。反应Inulin5与Annexin A2之间结合情况的RU值,随Inulin 5浓度的增加而升高。(5)分子对接显示 Inulin 5 与 Annexin A2 和 Annexin A2-S100A10 之间存在氢键和疏水作用。结论1.巴戟天寡糖由聚合度3-13的菊粉低聚糖组成,并可适度清除氮自由基。2.Inulin 5通过激活PI3K-Akt-eNOS信号传导通路,保护缺氧/复氧损伤HUVECs,促进细胞周期进程和小管形成。3.Annexin A2是Inulin 5保护缺氧/复氧损伤人脐静脉内皮细胞的主要靶蛋百之一。