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本文采用两种不同的方法分别从烟草和欧洲黑杨中分离出核基质附着区,并把它们构建到植物表达载体中,研究它们对转基因表达的调控作用。
以PCR方法从烟草基因组中扩增到两个DNA片段(M14和M17)的序列分析表明,它们具有90﹪A-Tbox,A-box,T-box,拓扑异构酶Ⅱ识别位点,自主复制序列(ARS),碱基非配对区(BUR),MAR识别序列(MRS),复制起始点(ORI),弯曲DNA序列等典型的MAR序列特征。将它们分别构建到植物表达载体pCAMBIA2301GUS基因(uidA)表达盒一侧及两侧,通过农杆菌介导转化烟草。组织化学染色法定性检测GUS活性表明,带有M14和M17的uidA基因在转基因烟草中稳定表达。GUS活性的定量检测表明,表达载体uidA基因一端或两端连接有MAR的转化烟草中,GUS的表达水平与对照相比都有了明显提高,而uidA基因两侧连有MAR的载体其提高表达水平的效果优于一端连有MAR的载体,可使GUS活性增强3.14倍,但不同转化个体之间表达水平的差异仍然明显。上述结果表明,所得DNA序列为两条新的MAR片段,并且具有提高转基因表达水平的功能。
采用高盐方法从欧洲黑杨悬浮细胞中分离到两个DNA片段,并对它们的序列进行了详细的分析。发现它们具有MARs序列的部分特征基元如:90﹪A-Tbox,A-box,T-box,拓扑异构酶Ⅱ识别位点,自主复制序列,碱基非配对区,MAR识别序列,复制起始点,弯曲DNA序列等。将它们构建到植物表达载体pCAMBIA1305.1中GUS基因(uidA)表达盒一侧,通过农杆菌介导转化烟草。组织化学染色法定性检测GUS活性表明,uidA基因在转基因烟草中稳定表达。GUS活性的定量检测表明,含有单拷贝A7、A23的转化烟草中GUS的表达水平与对照相比,不但没有提高,反而低于对照,说明插入的MAR片段对uidA基因的表达没有起到增强作用,反而抑制其表达。
研究结果表明,MARs具有多样性,不同的MARs可能执行着不同的功能。有些MARs不能降低转基因表达的差异,这说明并非所有的MARs都具有边界因子的功能或消除转基因沉默的能力;一些MARs不仅具有一般的特征,还具有其特异性,这种特异性使对MARs功能的研究复杂化,用不同的MARs序列研究的结论很可能是不一致的。