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猪流行性腹泻病毒(Procine epidemic diaherra virus,PEDV)属于冠状病毒科α冠状病毒属,是一种单股正链RNA病毒,能够引起猪流行性腹泻(Procine epidemic diaherra,PED)。1971年PEDV发现于欧洲,1978年比利时分离到经典毒株CV777。2010年新出现的PEDV突变株引起仔猪急性水样腹泻,病死率高达80%~100%,给世界和我国养猪业造成了巨大的经济损失。microRNAs(miRNAs)是一类多功能的小RNA,一些miRNAs在病毒的感染过程中通过调控宿主的天然免疫而发挥抗病毒作用。本文分离鉴定了一株PEDV毒株,进行了PEDV感染猪小肠上皮细胞(swine intestinal epithelial cells,SIEC)的miRNAs组学分析,然后重点研究了miR-221-5p和miR-615对PEDV复制过程的影响及机制,获得了以下结果:1.PEDV区域流行毒株的分离鉴定和全基因序列的分析本研究从临床PEDV阳性病料中分离到了一株PEDV毒株,进行了全基因组测序和分析,结果显示,病毒基因组全长28063 nt,包括5’(300 nt)和3’(500 nt)的非翻译区;全基因组进化分析发现,该毒株属于G2流行毒株组,与近年分离的毒株亲缘关系最近;该毒株S基因没有出现插入和删除,ORF3基因也没有发生缺失。将分离鉴定的PEDV毒株命名为CH/HBTS/2017。2.PEDV感染的SIEC miRNAs组学分析(1)用疫苗毒株CV777和ORF3缺失的强毒株NW17感染SIEC后,应用高通量测序方法鉴定miRNAs的表达差异。结果显示,不同毒力的PEDV毒株感染SIEC后均改变了细胞miRNAs的表达谱。共鉴定了229个miRNAs成熟体和232个前体。表达分析表明,CV777 vs.Mock有102个差异miRNAs,NW17 vs.Mock组有97个差异miRNAs,其中有78个miRNAs在这两组差异基因中同时出现。(2)对差异的miRNAs进行靶基因预测,并将靶基因进行GO和KEEG分析,结果显示NF-κB、MAPK、TLR等信号通路参与了PEDV感染的过程,进一步分析发现NF-κB通路具有最高的富集分数。3.miR-221-5p通过靶向病毒基因组和激活NF-κB通路抑制病毒的复制(1)应用ViTa数据库预测靶向病毒基因组的miRNAs,发现miR-221-5p同时靶向30个PEDV毒株3’端最保守的区域。利用miR-221-5p模拟物,转染SIEC、Vero和Marc-145细胞后都可以抑制PEDV复制,并且在Marc-145细胞中的抑制作用最强。(2)发现miR-221-5p可以与病毒3’UTR靶标区域结合。与天然免疫缺陷的Vero细胞相比,miR-221-5p在Marc-145细胞中发挥更强的抑制PEDV复制的作用。上调IFN-α、IFN-β和干扰素刺激基因ISG15的表达。进一步研究发现,miR-221-5p主要通过影响NF-κB通路发挥作用,证明NF-κB的启动子被激活;确认p65的核转位增加,进一步探明p65的入核是由于IκB的减少所致。(3)用Targetscan程序进一步预测了miR-221-5p的靶基因,筛选了5个在NF-κB通路的靶基因,双荧光素酶报告基因试验显示,miR-221-5p可以与SOCS1和NFKBIA基因结合,并且下调了这两个蛋白的表达。通过对SOCS1和NF-κB的敲低和过表达发现,SOCS1和NFKBIA可以在PEDV感染时抑制NF-κB通路,进一步探明miR-221-5p通过下调这两个负调控因子来激活NF-κB通路。4.miR-615通过靶向IRAK1调控Ⅲ型干扰素(IFN-Ⅲ)的表达来促进病毒复制(1)高通量测序的数据显示,在PEDV感染的SIEC细胞中miR-615下调。过表达miR-615可以促进PEDV在SIEC细胞中的复制,而敲低miR-615可以抑制PEDV在SIEC细胞中的复制。(2)过表达miR-615,Ⅰ型干扰素和Ⅲ型干扰素都被下调,其中,IFN-λ1和IFN-λ3下调更明显。(3)用miRanda、RNAhybrid和PITA3个数据库的预测miR-615的靶基因发现,IRAK1是miR-615的靶基因。双荧光素酶报告基因试验证明miR-615可以结合IRAK1靶基因区域。敲低IRAK1后,IFN-λ1和IFN-λ3的表达下降;过表达IRAK1后,IFN-λ1和IFN-λ3转录水平表达上调。并且,miR-615可以下调IRAK1的蛋白水平。将miR-615与IRAK1共转染,结果显示,IRAK1逆转了miR-615转染引起的IFN-λ1和IFN-λ3的下调和病毒复制的增加。综上所述,分离到了一株PEDV毒株;PEDV感染SIEC的过程中改变了miRNAs的表达谱。miR-221-5p通过调控IκB和SOCS1蛋白激活了NF-κB通路,从而抑制PEDV复制;miR-615通过调控IRAK1抑制了NF-κB的激活,从而促进PEDV的复制,说明NF-κB通路在PEDV感染过程中起了重要作用。本研究揭示了miRNAs可以通过调控天然免疫通路来影响PEDV复制,为阐明PEDV致病机理提供了新的科学资料。