论文部分内容阅读
目的探讨抗原负载类型的优化方案以及不同来源的D-CIK的抗肿瘤效应的差异,为寻找临床上抗肿瘤作用最佳的细胞类型提供新的方法。方法1.肿瘤细胞培养及肿瘤抗原制备利用组织酶消化法从新鲜肝癌组织中培养出自体肝癌细胞,反复冻融法制备自体肝癌细胞全抗原和购买的异体肝癌细胞系(BEL-7402)抗原。2.DC的诱导培养、抗原负载及表型分析抽取肝癌病人50ml外周血,密度梯度离心法搜集单个核细胞(PBMCs),经2h培养后,贴壁细胞可经GM-CSF、IL-4、TNF-α诱导成熟成为DC细胞。将方法1制备的肿瘤抗原于第6日和DCs混合培养以负载DCs细胞。收集第8日DCs进行表型检测。3.CIK细胞的诱导培养、D-CIK细胞培养及表型分析上述非贴壁细胞经IFN-γ、CD3Mb、IL-2诱导成为CIKs,第8日将负载抗原的DC与CIKs混合培养从而形成D-CIK细胞,动态观察CIKs细胞的增殖情况。收集第15日CIKs行流式细胞检测。4.CIK细胞杀伤试验检测将CIKs分为三组:单纯CIKs、异体Ag-D-CIK、自体Ag-D-CIK,MTT法检测三种CIKs对原代肝癌细胞的杀瘤效用及其发挥作用的量效关系,分别通过对肝癌及乳腺癌的杀伤活性观察CIKs的靶向特异性。结果1.DC细胞形态及表型分析DCs于诱导第3日出现细胞突起,呈现不规则形状,第5日细胞呈多角形改变,第7日经肿抗原负载及TNF-α诱导成熟,胞体呈现明显的树突状改变。经流式检测结果显示经抗原负载的DC表面标志CD80、CD83表达率较无负载组高(p<0.01)。2.CIK细胞形态、增殖速度及表型分析初始的CIKs细胞小而圆,胞质较少,细胞数量较少,CIKs细胞的增殖在第3d开始明显变化,胞体逐渐增大,胞浆丰富,悬浮细胞出现集簇生长,数量开始增加,第8d加入抗原负载的DCs后,细胞扩增速率达到最高,第21日后细胞扩增速度明显减缓。与单纯CIKs组、异体Ag-D-CIK相比,自体Ag-D-CIK组CD3+CD8+、CD3+CD56+的表达比例最高。3.细胞杀伤实验相同效靶比下三组CIKs细胞杀伤活性有显著差异,抗原负载组大于单纯CIKs组,而自体抗原负载组大于异体抗原负载组且各组细胞溶瘤活性随效靶比的提高而逐渐提高。效靶比为20:1时,自体抗原负载D-CIK对肝癌细胞杀伤活性(56.24±0.56%)优于乳腺癌细胞杀伤活性(31.18±0.54%)。结论1.抗原的负载能够诱导DCs的成熟,提高DCs免疫表型的表达,增强DCs的抗原呈递功能。2.将抗原致敏的DCs与CIKs共培养的D-CIK具有更强大的增值能力及杀伤力。3.经新鲜肿瘤细胞全抗原负载的DCs诱导培养的D-CIK能够发挥特异性的抗肿瘤作用。