苦瓜(Momordica charantia L.)隶属于葫芦科(cucurbiteae)苦瓜属，它不仅是我国及东南亚各国人民喜爱的传统蔬菜，也是一种重要的药用植物。苦瓜具有清热、解毒、降血糖、抗生育、抗癌和抗艾滋病等功效。已分离纯化出苦瓜凝集素(Momordica Charantia Lectin，MCL)；α—苦瓜素(α—Momorcharin)；β—苦瓜素(β—Momorcharin)；苦瓜抑制剂(Momordica Charantia Inhibitor，MCI)以及核糖体失活蛋白(Ribosome Inactivating Protein，RIP)，和苦瓜免疫缺陷病素Ⅰ型抑制剂(Inhibitor of VIH—Ⅰ)等多种苦瓜种仁蛋白。近年来，又从新鲜苦瓜原汁中，提纯出一些新的化学成分，主要为苦瓜素甙、胡萝卜甾醇和抗生育活性成分。但有关苦瓜组织培养的研究很少，其离体繁殖技术至今尚未得到解决，严重影响了珍稀濒危品种的保存和繁殖。本试验通过组织培养首次由外植体形成愈伤组织，愈伤组织分化出不定芽，不定芽产生试管苗，初步建立了一个完整的苦瓜离体繁殖体系。为苦瓜的遗传转化奠定了基础，开辟了新的品种改良途径。并分离得到了苦瓜开花相关基因BAG。试验结果如下： 1．苦瓜容易诱导出愈伤组织。外植体在含激素的培养基上产生愈伤组织的过程中对激素种类，用量不敏感，愈伤组织的诱导频率一般为90.0％左右。在愈伤组织起始发生的时间上，幼根、上胚轴、下胚轴、子叶、幼叶等各营养器官的外植体间无明显差异，一般外植体接种四天后开始膨大。愈伤组织的生长速度上，不同组织器官间存在着显著差异。实验表明，幼根、下胚轴、子叶等外植体愈伤组织的生长速度较快；上胚轴、幼叶等外值体的愈伤组织生长速度较慢。四川大学博士学位论文 2.苦瓜外植体所形成的愈伤组织从形态学上可分为三种不同的类型:绿色愈伤组织;黄绿色愈伤组织和黄色的愈伤组织。在愈伤组织分化形成不定芽的过程中，植物激素的种类，用量及所用愈伤组织的类型非常重要。绿色愈伤组织和黄绿色愈伤组织在培养基(MS十6一BA+KT)上成功地诱导分化出不定芽，最高分化频率是66.7%;黄色愈伤组织即使在适宜条件下也不能分化出不定芽。 3.筛选出培养基(MS+zT 5.0 mgl一‘+K T o.smgl一今较为适合芽的增殖。增殖系数为5一6，且幼芽的基部产生较少的愈伤组织。 4.培养基1/2 MS+ZT 0.02 mgl一‘或1/2 MS有助于幼芽离体生根，这两种培养基既有利于幼芽长出新根，又不至于在幼芽基部产生太多的愈伤组织，影响试管苗的移栽成活率，是苦瓜幼芽离体生根较为适合的培养基。 5.试管苗经大田移栽试验，成活率约为70.既，其性状与种子苗无明显差异。 6.采用RT一PCR和5’末端快速扩增法成功地克隆了苦瓜开花相关基因BA民cDNA全长1001个碱基，包含一个完整的，编码228个氨基酸的开放读码框(OpenReading Frame)。5’末端非翻译区由50个碱基组成。3’末端非翻译区含267个碱基，其中包括由22个碱基组成的ploy(A)‘尾巴及位于833bp处的ploy(A)‘加尾信号(从T拟认)。GenBank登录号为:AY 178837。BA‘基因是拟DS一box基因，含有完整的MADS~box(氨基酸序号1一58)和K一box(氨基酸序号88一193)，与多种植物的MADS一box蛋白具有很高的同源性。与黄瓜(cucu刃jssatz’憋)以DS一box Protein‘Z服l口的同源性为95%，与棉花(曲ss动ier hlr万ut姗)MADSbox Protein份旅爪7S二2的同源性为84%，与拟南芥栩厂日bz’故沪Sjs动ali日na)拟DS一box Protein AGLn的同源性为72%;同典型的毗DS一box基因AP3、A夕活0、夕乙沪讨、J倾二脚、‘5万沪，的毗DS一box区域分别有46、38、44、45、34个氨基酸残基相同。同源性分别为80%、66%、76%、78%、59%。Southern杂交分析标明，BA口基因在苦瓜基因组中有2或3个拷贝，属于低拷贝数的基因。Northern杂交和RT一PCR检测证实，BA吞基因在苦瓜花的雄蕊、心皮中大量表达，杂交信号强烈，在其它的组织、器官中没有明显的杂交信号。其中心皮的表达量最为丰富。这种表达模式与控制黄瓜花发育的MADS一box基因cA必的表达模式相同。 7.提取苦瓜基因组总DNA，构建DNA步移文库，根据BA口基因的已知序列设计引物，通过染色体步移技术克隆出别口基因起始密码子上游调控序列BAGP。四川大学博士学位论文对BAGP的鉴定和分析表明其具备大多数高等植物启动子的保守元件，预测它对别‘基因的表达具有一定的作用。为鉴定BA‘基因的基本启动子元件，将基因5’侧翼序列做缺失片段分析，利用PCR方法从BAGP中得到三个大小不等两端带有Hz’ndIII、山斑厅I酶切位点的片段BAGPI，BAGPZ和BAGP3，定向插入载体pMGFP4(pBI221改建，报告基因为GFP)中，取代原有的C蒯V35S启动子，构建了由驱动报告基因 GFP的植物表达载体SAGPVI，BAGPVZ和BAGPV3，用于农杆菌介导的拟南芥遗传转化。为进一步在模式植物中研究其表达功能奠定了基础。 8.将苦瓜开花相关基因(BA必的编码区片段定向克隆到pQE一30质粒后，获得重组质粒pQE一BAG。用该重组质粒转化大肠杆菌M15菌株，所获得的阳性转化子经菌落Western检测表达产物。结果表明，在IPTG诱导条?