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目的:研究促红细胞生成素(EPO)对糖基化终末产物(AGEs)诱导的牙周膜干细胞(PDLSCs)细胞周期、凋亡、氧化应激损伤、成骨分化能力降低的逆转作用,p38 MAPK和Wnt/β-catenin信号通路的调控作用以及促红细胞生成素对糖尿病牙周炎牙周骨吸收的抑制作用。AGEs对PDLSCs成骨分化中差异基因和富集通路的影响。方法;(1)人牙周膜干细胞的分离培养和成骨成脂分化诱导,检测间充质干细胞表面标志物CD44、CD90和CD105的表达及造血干细胞表面标志物CD34和CD45的表达。(2)检测EPO对AGEs诱导的PDLSCs氧化应激损伤(ROS、MDA、SOD)的逆转作用。(3)使用流式细胞仪检测AGEs干预PDLSCs 24h后对细胞周期和细胞凋亡的作用以及 EPO 的逆转作用,Westemblot 检测 Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、p21、p53和CyclinDl蛋白的表达。(4)采用 GeneChip HTArray 2.0(Affymetrix,美国)芯片筛选 AGEs 作用下的成骨诱导组与单纯成骨诱导组PDLSCs的差异基因,并通过聚类分析、差异基因功能分析和信号通路分析等分析方法对AGEs造成的牙周膜干细胞成骨分化能力下降进行初步分析。(5)使用 Realtime PCR和 Westernblot 检测 AGEs 诱导及 EPO 干预 7d 和 14dALP、Runx2、Osterix、OCN的表达,茜素红染色和定量分析矿化结节的形成情况,同时检测p38 MAPK信号通路和Wnt/β-catenin信号通路的关键蛋白β-catenin、CyclinD1、p-p38、p-GSK3β、p38 和 GSK3β 的表达。(6)建立糖尿病牙周炎大鼠模型,并在EPO干预后使用苏木素-伊红染色和免疫组化染色检测大鼠牙周组织中RANKL-OPG、iNOS、TNF-β的表达。结果:(1)使用组织块法培养并纯化PDLSCs,成骨成脂诱导成功,CD44、CD90和CD105均呈阳性表达阳性率均在98%以上。CD45及CD34均呈阴性表达(<1%)。(2)经 AGEs 诱导 24h 后,PDLSCs 内 ROS、MDA 升高,SOD 下降,EPO 能够发挥显著的抗氧化剂作用,降低ROS、升高SOD,显著提高细胞对氧自由基的清除能力,并降低细胞内MDA含量。(3)AGEs能够显著增加处于G1/Go期的PDLSCs细胞数,减少处于G2/M期的细胞数,引发G1/G0期阻滞,抑制PDLSCs细胞增殖。50U/ml、100U/ml和200U/ml EPO组同时加入20μg/ml AGEs干预后,PDLSCs的G1/Go期阻滞发生逆转,处于G1/G0期的PDLSCs细胞数明显减少,随着EPO浓度的升高p53蛋白和p21蛋白表达逐渐下降,CyclinD1蛋白的表达逐渐升高,细胞周期趋于正常。AGEs能够通过改变Bax/Bcl-2关键蛋白比率,激发下游的Caspase级联效应诱导PDLSCs凋亡。EPO能够增强PDLSCs中Bcl-2的蛋白表达,以对抗由AGEs诱导的Bax过表达,同时抑制Bax-Bcl-2下游的Caspase级联效应,减弱由AGEs诱导的凋亡启动(Caspase-9)和凋亡效应(Caspase-3)信号达到减少细胞凋亡的作用。(4)我们筛选了 AGEs+成骨诱导与单纯成骨诱导组间的差异基因并通过聚类分析、差异基因功能分析和信号通路分析等分析方法寻找AGEs对PDLSCs生物学行为调控的潜在靶点,为后续我们对EPO逆转AGEs诱导的牙周膜干细胞成骨分化能力下降的研究提供了基础。(5)AGEs能够明显抑制PDLSCs的成骨分化能力,主要表现为Runx2、OCN和Osterix三者的表达水平在成骨诱导14d后明显低于单纯诱导组,茜素红矿化沉积染色也明显低于单纯诱导组。在加入50U/ml EPO后,我们发现EPO能够部分逆转AGEs造成的PDLSCs的成骨分化能力下降,提高Runx2、OCN和Osterix成骨相关蛋白的的表达,增加矿化沉积。AGEs浓度升高(0μg/ml、1Oμg/ml、50μg/ml)p38磷酸化和GSK3β磷酸化受到阻滞,随着EPO浓度的增加,能够明显升高PDLSCs中β-catenin蛋白和CyclinD1蛋白的表达,增加p38磷酸化和GSK3β磷酸化,对PDLSCs的成骨分化能力起到一定的保护作用。(6)与正常对照组大鼠的牙周组织相比,糖尿病牙周炎大鼠牙周组织中OPG蛋白表达量明显下降,染色程度明显减弱,RANKL阳性表达细胞明显增多,RANKL-OPG比例明显升高,iNOS呈明显阳性,NO浓度明显升高,TGF-β1活性受到抑制,破骨细胞活跃,骨吸收明显。EPO干预后,OPG蛋白表达量明显升高,染色程度明显增强,RANKL阳性表达细胞明显减少,染色程度减弱,iNOS表达明显减弱,NO浓度降低,TGF-β1活性升高。结论:(1)EPO能够逆转AGEs诱导的PDLSCs的细胞周期阻滞和凋亡,其主要机制是抑制AGEs诱导的PDLSCs氧化应激损伤及p53活化途径及下游的凋亡启动和凋亡效应蛋白的表达。(2)EPO能够激活Wnt/β-catenin信号通路促进PDLSCs成骨分化,升高PDLSCs中成骨相关因子OCN、Osterix、Runx2表达,并增加钙盐沉积形成矿化结节;EPO能够部分逆转AGEs造成的PDLSCs成骨分化能力下降,其机制主要是EPO同时调控Wnt/β-catenin信号通路和p38-MAPK信号通路。(3)EPO能够部分逆转高糖和牙周炎症引起的牙槽骨吸收,起到一定的骨稳态维持作用和牙周组织保护作用。