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第一部分AngⅡ诱导非小细胞肺癌细胞上皮间质转化及机制研究目的:转移和侵袭已成为恶性肿瘤的基本特征和重要标志,上皮间质转化(EMT)已被证实可促进肿瘤细胞的局部浸润和癌症的全身散播。肾素-血管紧张素系统(RAS)是体内一个重要的神经-体液调节系统,其中血管紧张素II(Ang II)是其主要的效应分子。近年来发现Ang II在局部组织,特别是肿瘤组织中表达明显,已被证实对肿瘤的发生、发展和转移起到重要作用,但其对肿瘤细胞EMT的作用则鲜有研究。目前RAS在肿瘤中的相关研究主要集中于血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)对肿瘤细胞的影响,而AngⅡ对肿瘤细胞直接影响的研究较少。因此,本研究探讨AngⅡ对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞EMT的影响和相关作用机制,旨在从新的角度完善RAS在肿瘤领域的研究,以期为肿瘤治疗提供新的理论基础和可能的治疗策略。方法:以A549细胞和H460细胞为研究对象开展如下实验:(1)采用划痕实验和Transwell迁移实验检测细胞的迁移运动能力;(2)采用Transwell小室侵袭实验检测细胞的侵袭能力;(3)采用Western blot和免疫荧光检测细胞中相关蛋白的表达及分布;(4)采用qRT-PCR检测细胞中相关mRNA水平;(5)采用活体成像技术检测裸鼠尾静脉肺转移模型中A549细胞的分布及转移情况;(6)ELISA试剂盒检测细胞上清液中TGF-β1的含量。结果:(一)AngⅡ诱导A549细胞EMT的作用1.划痕实验和Transwell实验结果显示,AngⅡ可促进A549细胞和H460细胞划痕的愈合,增加Transwell迁移实验穿膜细胞数,而对细胞的侵袭能力无明显影响,提示AngⅡ可能对NSCLC细胞的迁移能力有一定的促进作用。2.Western blot和qRT-PCR实验结果显示,AngⅡ可下调A549细胞中Ecadherin蛋白,上调Vimentin蛋白,提高Slug、Snail、Zeb1的mRNA水平,但对H460细胞EMT相关蛋白标志物的表达无明显影响,提示AngⅡ可诱导A549细胞EMT。3.裸鼠尾静脉肺转移实验结果显示,AngⅡ组裸鼠肺部荧光面积更大,荧光强度更强;大体图片和HE染色结果表明,AngⅡ组肺脏组织中结节明显增多,提示经AngⅡ处理后的A549细胞具有更强的肺部转移能力。(二)AngⅡ诱导A549细胞EMT的机制1.Western blot和qRT-PCR实验结果显示,AngⅡ可上调转化生长因子-β1(TGF-β1)的蛋白表达和mRNA水平,ELISA结果显示,AngⅡ可增加A549细胞上清液中TGF-β1的含量;TGF-β受体拮抗剂SB431542可抑制AngⅡ诱导EMT过程,提示AngⅡ通过促进TGF-β1转录翻译,增加TGF-β1蛋白表达,诱导EMT。2.Western blot和qRT-PCR实验结果显示,AngⅡ可上调沉默信息调节因子2相关酶I(SIRT1)的蛋白表达和mRNA水平;SIRT1抑制剂EX527可抑制AngⅡ诱导EMT过程;TGF-β1受体拮抗剂SB431542抑制AngⅡ上调SIRT1蛋白表达,提示AngⅡ可通过TGF-β1增加SIRT1蛋白表达,诱导EMT。结论:AngⅡ通过TGF-β1上调SIRT1,诱导A549细胞EMT,提高A549细胞迁移和转移能力。第二部分20(S)-原人参二醇对AngⅡ诱导A549细胞EMT的干预作用和机制研究目的:关于ACEI和ARB对肿瘤转移的抑制作用多有报道,被认为是极具应用前景的抗肿瘤转移新策略。本实验室前期研究中发现,人参总皂苷和20(S)-原人参二醇组皂苷在不同的情况下,可增加Ang II降解,减少局部组织中Ang II的水平,发挥对心、肾、肝的保护作用。20(S)-原人参二醇(PPD)是从人参(西洋参)的根、茎、叶中提取得到的20(S)-原人参二醇组皂苷的苷元,是二醇型皂苷肠道代谢的最终产物之一。已证实PPD具有良好的抗肿瘤作用,但多集中于诱导凋亡方面,而对肿瘤细胞转移的抑制作用报道较少。因此,本文研究PPD对Ang II诱导A549细胞EMT的作用,可为PPD临床适应症的选择提供实验依据,为中药抗肿瘤药物的研发提供一种新的思路和理论依据。方法:以A549细胞为研究对象开展如下实验:(1)采用划痕实验和Transwell迁移实验检测细胞的迁移运动能力;(2)采用Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力;(3)采用Western blot和免疫荧光检测细胞中相关蛋白的表达及分布;(4)采用qRT-PCR检测细胞中相关mRNA的水平;(5)采用活体成像技术检测裸鼠尾静脉肺转移模型中A549细胞分布及转移情况;(6)采用ELISA试剂盒检测细胞上清液中TGF-β1的含量。结果:(一)PPD对AngⅡ诱导A549细胞EMT的抑制作用1.划痕实验和Transwell迁移实验结果显示,PPD可抑制AngⅡ对A549细胞划痕愈合的促进作用,减少Tranwell迁移实验中因AngⅡ增加的穿膜细胞数,但对A549细胞迁移能力无明显影响,提示PPD可抑制AngⅡ对A549细胞迁移能力的促进作用。2.Western blot和qRT-PCR实验结果显示,PPD可拮抗AngⅡ作用,上调Ecadherin蛋白,下调Vimentin蛋白,降低Slug、Snail、Zeb1的mRNA水平,提示PPD可抑制AngⅡ诱导的A549细胞EMT。3.裸鼠实验结果显示,PPD可降低AngⅡ组裸鼠肺部的荧光面积和强度,减少肺脏组织中结节数量和大小,提示其可抑制AngⅡ处理后的A549细胞体内转移。(二)PPD抑制AngⅡ诱导A549细胞EMT的作用机制1.Western blot结果显示,PPD可抑制AngⅡ诱导的TGF-β1蛋白表达增加;ELISA结果显示,PPD可减少AngⅡ诱导的A549细胞上清液中TGF-β1含量增加,提示PPD可抑制AngⅡ诱导的TGF-β1自分泌。2.Western blot和免疫荧光结果显示,PPD可以抑制AngⅡ对SIRT1的上调作用;瞬时转染使SIRT1过表达或EX527抑制SIRT1表达,上调SIRT1的蛋白水平可有效拮抗PPD对EMT的抑制作用,而PPD和EX527产生了协同作用,可逆转AngⅡ对EMT蛋白标志物以及转录因子的影响,证实SIRT1是PPD抑制EMT的重要蛋白之一,提示PPD通过下调SIRT1抑制AngⅡ诱导A549细胞EMT。结论:PPD可抑制AngⅡ刺激A549细胞分泌TGF-β1,下调SIRT1,从而抑制EMT,这是其发挥抗迁移及抗转移作用的机制之一。