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内皮祖细胞（endothelial prcgenitor cells，EPCs）是一类能高度增殖、特异性的分化为血管内皮细胞、但尚未表达成熟血管内皮细胞表型的前体细胞。大量研究表明，成年个体体内的EPCs不仅参与血管形成（angiogenesis），同时也参与出生后血管发生（vasculogenesis）和血管内膜损伤后修复。近来研究表明内皮功能不全在冠心病的发生、发展中扮演了重要角色。EPCs能通过修复内皮损伤，保持内膜完整性，从而抑制局部粥样硬化斑块和血栓的形成。然而诸如老龄、糖尿病、高血压、高胆固醇血症、高同型半胱氨酸血症及吸烟等冠心病危险因素对循环EPCs数量和活性具有明显抑制作用。流行病学研究显示法国南部居民具有高胆固醇饮食习惯，然而其冠心病的发病率与死亡率却低于欧美其它地区，此即“法国悖论（French paradox）”。该现象被认为与该地区居民经常饮用红葡萄酒有关。白藜芦醇（resveratrol）是红葡萄酒中含量很高的一种非黄酮类多酚化合物，化学名为3，5，4’-三羟基二苯乙烯（3，5，4’-trihydroxy-stilbene），分子式为C14H12O3，分子量为228．2。天然的白藜芦醇存在于葡萄、花生、桑葚、虎杖等70多种植物中，是植物在应激犬态下（如紫外线照射、缺水、真菌感染等）产生的一种植物抗毒素。新近研究显示白藜芦醇对心血管系统具有多重效应，包括抑制动脉粥样硬化、保护心肌缺血再灌注损伤、逆转损伤血管新生内膜过度增生、调节血小板粘附与聚集、预防低密度脂蛋白氧化及升高密度脂蛋白等，被认为是介导红葡萄酒心血管保护作用的主要功能因子。然而，到目前为止，国内外关于白藜芦醇对EPCs数量和功能的直接影响的报道极少，特别是对其相关机制的研究未见报道。综合国内外文献，我们提出假设：白藜芦醇可以通过影响EPCs的数量和功能，继而影响内皮修复能力，维持内皮损伤和修复之间的动态平衡，促进内皮功能的恢复，进而延缓动脉粥样硬化的发生、发展。为此，我们首先观察了白藜芦醇体外干预对外周血EPCs数量和功能的影响，随后进一步探讨了白藜芦醇影响EPCs数量和功能的可能机制。以下分两部分对本研究的方法、结果以及结论作一简述。第一部分白藜芦醇对外周血内皮祖细胞数量和功能的影响目的：观察resveratrol体外干预对外周血EPCs数量和功能的影响。方法：采用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞，将其接种在人纤维连接蛋白包被的培养板，培养4d后，收集贴壁细胞，加入不同浓度resveratrol（10μmol/L，25μmol/L，50μmol/L和100μmol/L）干预，观察量效关系。多波长激光共聚焦显微镜鉴定FITC-UEA-Ⅰ和DiI-acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs，流式细胞仪检测其表面标志进一步鉴定EPCs。采用MTT比色法、改良的Boyden小室法、粘附实验、体外小管形成实验、ELISA实验分别观察EPCs的增殖能力、迁移能力、粘附能力、血管生成能力和分泌细胞因子能力。结果：Resveratrol能显著增加外周血EPCs数量，并能明显增加EPCs的增殖、迁移、粘附、血管生成和分泌细胞因子能力，并且作用呈浓度依赖性，在50μmol/L组（与对照组比较，EPCs数量85．8±26．0 vs 44．8±9．6/hpf，P＜0．01；增殖能力0．296±0．028 vs 0．196±0．015，P＜0．01；迁移能力24．0±5．2 vs 10．7±3．2/hpf,P＜0．01；粘附能力49±6．3 vs 30±5．0/hpf,P＜0．01；血管生成能力49±6．3 vs 26±4．2/hpf，P＜0．01；分泌细胞因子能力377±28．8 vs 282±20．1pg/mL，P＜0．01）达最大增加效应。结论：Resveratrol可增加EPCs数量并增强EPCs功能，且resveratrol对EPCs的影响呈一定的量效关系。第二部分白藜芦醇影响内皮祖细胞的机制研究——抑制内皮祖细胞的衰老目的：研究resveratrol对EPCs衰老的影响及其信号转导途径。方法：采用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞，将其接种在人纤维连接蛋白包被的培养板，培养4d后，换用新鲜培养基，并加入不同浓度resveratrol（10μmol/L，25μmol/L，501μmol/L和100μmol/L）干预，或先分别予以PI3K抑制剂（LY294002）、eNOS抑制剂（NG-mono-methyl-L-arginine，L-NAME）、无内在活性的雌激素受体拮抗剂（ICI182780，faslodex）预处理，然后再用50μmol/Lresveratrol干预。延长培养7d以诱导细胞衰老。采用SA-β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测衰老细胞。采用5-bromo-2′-deoxyuridine（BrdU）掺入实验、改良的Boyden小室法和集落生成实验检测EPCs的增殖、迁移和集落形成能力。FITC-AnnexinV/PI流式细胞仪检测EPCs凋亡。RT-PCR检测EPCs hTERT mRNA水平。端粒重复序列扩增法（telomeric repeat amplification protocol，TRAP）-聚丙烯酞胺凝胶电泳-银染法定性检测端粒酶活性，TRAP-ELISA定量检测端粒酶活性。Western blot实验检测EPCs Akt磷酸化水平。结果：Resveratrol干预能减少SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞数量，增加EPCs的增殖、迁移及集落形成能力，并且resveratrol的作用为浓度依赖性，在50μmol/L组达最大效应。Resveratrol对细胞衰老的作用可被LY294002阻断，但不能被L-NAME或ICI182780阻断。Resveratrol可以促进EPCs hTERT mRNA的表达，增加EPCs端粒酶活性。PI3K抑制剂可以抑制resveratrol对EPCs hTERT mRNA表达及端粒酶活性的促进作用。Western blot检测发现resveratrol可以促进Akt磷酸化。此外，50μmol/L resveratrol并不能明显减少EPCs凋亡。结论：Resveratrol延缓EPCs衰老，伴随EPCs增殖、迁移及集落形成能力的增加；resveratrol延缓EPCs衰老可能跟EPCs端粒酶活性增加及hTERT mRNA的表达上调有关；PI3K/Akt信号转导途径可能参与resveratrol延缓EPCs衰老的调控。