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研究背景:
阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)是一种慢性的神经系统退行性疾病，是老年期痴呆最常见的类型。主要表现是进行性的认知功能下降。随人口老龄化发展，其发病率有逐年上升的趋势，给家庭和社会带来了沉重的负担。但是AD的病因及发病机制仍不明确，并且缺乏有效的治疗方式。在过去的几十年里，研究表明多种因素和机制可能参与了AD的发生发展。氧化应激增强与线粒体功能障碍作为AD中重要的病理改变，近年来受到广泛关注。研究表明，氧化应激增强在AD早期阶段即已明显。根据AD的线粒体级联假说，线粒体功能障碍是导致AD神经元能量代谢异常和活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成增加的原因，造成突触损伤和神经元受损。另外，随着淀粉样蛋白(Amyloidbeta，Aβ)沉积加剧、Tau蛋白异常磷酸化加重，氧化应激进一步增强。氧化应激反应增强、线粒体功能障碍贯穿在AD发生发展的整个过程，是AD重要的病理生理事件。因此，针对AD线粒体功能障碍和抗氧化为靶点的的治疗策略得到越来越多的关注，尤其是早期干预措施得到了重视。
艾地苯醌(Idebenone，IDB)是辅酶Q10的合成类似物。与辅酶Q10不同的是它的羟基癸基侧链更短，更容易穿透细胞膜，靶向线粒体。既往的研究表明IDB具有抗氧化作用，能够抑制氧化应激反应和保护线粒体生物能学改变。事实上，艾地苯醌已在很多疾病临床治疗或研究中使用。艾地苯醌用于多种线粒体功能障碍相关的神经退行性疾病，如Friedreich性共济失调(FRDA)、Leber遗传性视神经病变(LHON)等，取得了一定的效果，并且安全性良好。然而关于艾地苯醌治疗AD的临床效果尚无一致结论，相应的基础研究较少，动物模型研究中也是短期使用，缺乏相应机制的研究。艾地苯醌的有效性仍有待进一步研究。由于AD的超早期已经出现典型神经病理变化，出现典型临床症状之后治疗或已不能逆转神经损伤，所以早期干预或可能有效预防AD的发生或遏制AD的进展。因此，我们在本研究中探讨早期预防性使用艾地苯醌能否对AD产生保护作用。本研究主要分两部分，第一部分首先使用小鼠体外培养的皮层神经元，加入Aβ1-42，构建AD的细胞模型，探讨艾地苯醌预处理在AD环境下对线粒体功能的是否有保护作用，并探索可能的相关机制;第二部分使用5xFAD小鼠作为AD小鼠模型，在5xFAD小鼠早期阶段预防性应用艾地苯醌，评估其对中期、晚期5xFAD小鼠的线粒体功能及认知功能的影响。
第一部分艾地苯醌对原代神经元中Aβ介导的线粒体损伤保护作用的研究
研究目的:
1.检测艾地苯醌预处理对Aβ介导的神经元线粒体氧化应激反应的影响;
2.检测艾地苯醌对Aβ环境下神经元线粒体生物产能功能的影响;
3.探讨艾地苯醌预处理对线粒体突触功能相关的PKA/CREB信号传导通路是否有保护作用;
研究方法:
1.构建AD细胞模型和药物处理
取出生1天以内的C57BL/6j小鼠皮层神经元，进行原代神经元的培养，加入Aβ寡聚体，构建AD细胞模型。使用艾地苯醌预处理，检测相应线粒体功能的变化。同时设立对照组。
神经元培养至12-14天进行药物预处理。先采用不同浓度的艾地苯醌预处理进行细胞活力检测，根据结果选择合适的艾地苯醌药物浓度。实验分组如下:溶剂对照组、Aβ处理组、sAβ(Scrambleβ-Amyloidprotein)处理组、IDB处理组、IDB+Aβ处理组、IDB+sAβ处理组。进行细胞线粒体功能测定时，1μM艾地苯醌预处理4小时后按分组不同分别给予1μMAβ、或sAβ继续共同孵育24小时。
2.原代培养:取出生1天以内的C57BL/6j小鼠，分离大脑皮层，取皮层神经元进行原代培养，将神经元种植于含有NeurobasalA、B-27TM、谷氨酰胺成分的培养基中，置于37℃含5％CO2的细胞培养箱内。
3.Aβ及scrambleAβ的制备:Aβ1-42、sAβ冻干粉离心后，加入到HFIP中，摇匀，并超声水浴以充分溶解，离心后取上清液过夜干燥形成肽膜，用DMSO溶解肽膜，然后用BCA法测蛋白浓度。
4.细胞毒性试验检测:使用用MTT试剂盒，检测不同浓度的艾地苯醌预处理对神经元细胞的活力的影响。使用酶标仪检测在550nm波长的吸光值，使用Gene5软件(BioTek)进行分析。为实验选择合适的药物浓度。
5.线粒体产能功能检测:使用AbcamATP分析检测试剂盒，检测各实验组的ATP产生量;
6.线粒体膜电位的检测:使用TMRM染色法检测线粒体膜电位，按说明书步骤操作，TMRM的工作浓度为20nM，浓度为200nM的MitoTrackerGreen染色与TMRM染色同时进行，使用倒置荧光显微镜连接活细胞工作站照相，图像使用显微镜自带软件进行分析。
7.线粒体超氧化物的测定:使用MitoSoxred染色法检测线粒体超氧化物的产生;MitoSoxRed工作浓度为2μM，在倒置荧光显微镜下观察照相，使用尼康NIS高级软件对红色强度进行分析。
8.蛋白免疫印迹:使用WesternBlotting法来检测线粒体突触功能相关的神经元中PKA、CREB、pPKA、pCREB的表达水平，膜在Bio-RadChemidoc成像系统上成像。用Imagelab软件(Bio-Rad)对印迹进行分析。
9.统计分析:本研究中的定量数据使用均数±标准误表示。使用GraphPadPrism5软件进行统计分析。组间比较采用单因素方差分析和Bonferroniposthoc分析。P＜0.05差异有统计学意义。
研究结果:
1.艾地苯醌浓度在0到10μM范围内对神经元细胞活性没有影响。当浓度高至100μM时神经元活力受到显著影响。我们使用的是1μM的IDB对神经元进行处理并继续以后的检测。
2.艾地苯醌预处理能够保护原代神经元线粒体的氧化应激功能，抑制线粒体超氧化物的形成。没有艾地苯醌预处理的神经元在Aβ干预下，线粒体超氧化物产生明显增加，而是经过艾地苯醌预处理的神经元在Aβ干预下MitoSoxRed红色强度则与溶剂对照组强度相当。
3.艾地苯醌对线粒体的生物产能功能有保护作用。神经元在Aβ干预下ATP产生明显减少，而是使用艾地苯醌后ATP产生量与对照组无差异。线粒体膜电位检测与ATP结果一致。单独给予Aβ干预的神经元TMRM染色强度明显下降，而艾地苯醌预处理并Aβ干预的神经元细胞组则染色强度与对照组水平无差异。
4.在Aβ环境下，艾地苯醌对线粒体功能的保护作用有利于PKA-CREB信号传导。Aβ组出现磷酸化的PKA及磷酸化的CREB表达水平下降(P＜0.001)，而艾地苯醌预处理组表达水平则未有明显变化。艾地苯醌抑制了Aβ引起的PKA-CREB信号传导通路的失活。
研究结论:
在不造成细胞毒性的条件下，艾地苯醌预处理能够抑制Aβ介导的线粒体超氧化物的产生;能够保存Aβ干预下线粒体的生物产能功能;能够保护与突触功能相关的PKA-CREB信号传导通路免受Aβ干预的影响。艾地苯醌对原代神经元中Aβ介导的线粒体功能损伤有保护作用;
第二部分艾地苯醌对5xFAD小鼠保护作用的研究
研究目的:
1.探讨艾地苯醌预处理对AD模型小鼠空间学习记忆能力的影响;
2.探讨艾地苯醌预处理对AD模型小鼠线粒体产能功能的影响;
3.探讨艾地苯醌预处理对AD模型小鼠脑内Aβ表达量的影响;
4.探讨艾地苯醌预处理对AD模型小鼠脑内突触密度的影响
研究方法:
1.动物模型的药物处理和分组
分组:遗传背景相同的小鼠经基因型鉴定后分到4组:①5xFAD小鼠药物组(5xFAD-Idebenone);②5xFAD小鼠对照组(5xFAD-Vehicle);③非转基因小鼠药物组(nonTg-Idebenone);④非转基因小鼠对照组(nonTg-Vehicle)。以上小鼠自3月龄开始每日腹腔注射，小鼠每周称重，按体重调整剂量。观察月龄为4月龄、8月龄(分别模拟AD的中期、晚期阶段)。药物组艾地苯醌的用法用量为100mg/kg(艾地苯醌悬液0.01ml/g)腹腔注射，每日一次;对照组为5％阿拉伯胶0.01ml/g，每日一次。
2.水迷宫行为学检测:使用六臂水迷宫系统，检测4月龄、8月龄5xFAD小鼠及对照组小鼠的空间学习记忆能力。
3.组织线粒体产能功能ATP检测:使用AbcamATP分析检测试剂盒，检测各实验组的ATP产生量;
4.Aβ40、Aβ42表达量的检测:采用ELLSA法检测脑内Aβ40、Aβ42的水平，分别对4月龄、8月龄的5xFAD转基因小鼠进行检测。
5.组织切片制备及免疫荧光染色:制备脑组织切片，使用免疫荧光染色法检测脑内突触密度的变化。
研究结果:
1.艾地苯醌对5xFAD小鼠空间学习记忆能力有保护作用。4月龄及8月龄5xFAD小鼠均出现了空间学习记忆能力的下降，而药物组(5xFAD-Idbenone)空间学习记忆能力要优于对照组(5xFAD-Vehicle)，差异有统计学意义。
2.艾地苯醌对5xFAD小鼠线粒体产能功能有保护作用。8月龄5xFAD小鼠ATP产生量明显减少，但是艾地苯醌治疗组ATP产生量要高于对照组。4月龄中则无显著差异。
3.艾地苯醌影响5xFAD小鼠脑内Aβ的代谢。早期使用艾地苯醌未对4月龄5xFAD小鼠脑内Aβ40、Aβ42水平造成影响，但是8月龄5xFAD小鼠艾地苯醌治疗后脑内Aβ42下降。说明长期使用艾地苯醌可以影响5xFAD小鼠脑内Aβ42代谢。
4.艾地苯醌对5xFAD小鼠脑内突触密度有保护作用。我们对小鼠脑片进行vGlut1与PSD-95免疫荧光染色来确定突触数目，在共聚焦显微镜下观测。结果发现4月龄和8月龄的5xFAD小鼠，突触均出现明显减少;而接受艾地苯醌治疗的5xFAD小鼠海马CA1区中突触密度均明显高于对照组。
另外，在非转基因小鼠中，艾地苯醌治疗并未对小鼠的空间学习记忆能力、Aβ表达量、线粒体功能、突触造成影响。我们认为实验剂量的艾地苯醌在正常小鼠中使用是安全的。
研究结论:
艾地苯醌预处理能够改善AD模型小鼠(5xFAD)的空间学习记忆能力，对线粒体功能有一定的保护作用，能够减少5xFAD小鼠脑内的Aβ含量，对脑内的突触数目有保护作用。所以，AD早期阶段使用艾地苯醌对中晚期阶段5xFAD小鼠有保护作用。另外，实验剂量的艾地苯醌在正常小鼠中使用是安全的。
结论(全文):
1.在细胞水平，在不造成细胞毒性的条件下，艾地苯醌能够抑制Aβ介导的线粒体超氧化物的产生;能够保存Aβ干预下线粒体的生物产能功能;能够保护与突触功能相关的PKA-CREB信号传导通路免受Aβ干预的影响。艾地苯醌对原代神经元中Aβ介导的线粒体功能损伤有保护作用;
2.在AD动物模型中，AD早期阶段使用艾地苯醌对中晚期阶段5xFAD小鼠空间学习记忆能力、线粒体功能、突触数目有一定的保护作用，能够减少5xFAD小鼠脑内的Aβ含量。另外，实验剂量的艾地苯醌在正常小鼠中使用是安全的。
因此，使用艾地苯醌作为一种预防策略早期并长期使用，可能具有减低风险、减缓病程进展的潜力。
阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)是一种慢性的神经系统退行性疾病，是老年期痴呆最常见的类型。主要表现是进行性的认知功能下降。随人口老龄化发展，其发病率有逐年上升的趋势，给家庭和社会带来了沉重的负担。但是AD的病因及发病机制仍不明确，并且缺乏有效的治疗方式。在过去的几十年里，研究表明多种因素和机制可能参与了AD的发生发展。氧化应激增强与线粒体功能障碍作为AD中重要的病理改变，近年来受到广泛关注。研究表明，氧化应激增强在AD早期阶段即已明显。根据AD的线粒体级联假说，线粒体功能障碍是导致AD神经元能量代谢异常和活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成增加的原因，造成突触损伤和神经元受损。另外，随着淀粉样蛋白(Amyloidbeta，Aβ)沉积加剧、Tau蛋白异常磷酸化加重，氧化应激进一步增强。氧化应激反应增强、线粒体功能障碍贯穿在AD发生发展的整个过程，是AD重要的病理生理事件。因此，针对AD线粒体功能障碍和抗氧化为靶点的的治疗策略得到越来越多的关注，尤其是早期干预措施得到了重视。
艾地苯醌(Idebenone，IDB)是辅酶Q10的合成类似物。与辅酶Q10不同的是它的羟基癸基侧链更短，更容易穿透细胞膜，靶向线粒体。既往的研究表明IDB具有抗氧化作用，能够抑制氧化应激反应和保护线粒体生物能学改变。事实上，艾地苯醌已在很多疾病临床治疗或研究中使用。艾地苯醌用于多种线粒体功能障碍相关的神经退行性疾病，如Friedreich性共济失调(FRDA)、Leber遗传性视神经病变(LHON)等，取得了一定的效果，并且安全性良好。然而关于艾地苯醌治疗AD的临床效果尚无一致结论，相应的基础研究较少，动物模型研究中也是短期使用，缺乏相应机制的研究。艾地苯醌的有效性仍有待进一步研究。由于AD的超早期已经出现典型神经病理变化，出现典型临床症状之后治疗或已不能逆转神经损伤，所以早期干预或可能有效预防AD的发生或遏制AD的进展。因此，我们在本研究中探讨早期预防性使用艾地苯醌能否对AD产生保护作用。本研究主要分两部分，第一部分首先使用小鼠体外培养的皮层神经元，加入Aβ1-42，构建AD的细胞模型，探讨艾地苯醌预处理在AD环境下对线粒体功能的是否有保护作用，并探索可能的相关机制;第二部分使用5xFAD小鼠作为AD小鼠模型，在5xFAD小鼠早期阶段预防性应用艾地苯醌，评估其对中期、晚期5xFAD小鼠的线粒体功能及认知功能的影响。
第一部分艾地苯醌对原代神经元中Aβ介导的线粒体损伤保护作用的研究
研究目的:
1.检测艾地苯醌预处理对Aβ介导的神经元线粒体氧化应激反应的影响;
2.检测艾地苯醌对Aβ环境下神经元线粒体生物产能功能的影响;
3.探讨艾地苯醌预处理对线粒体突触功能相关的PKA/CREB信号传导通路是否有保护作用;
研究方法:
1.构建AD细胞模型和药物处理
取出生1天以内的C57BL/6j小鼠皮层神经元，进行原代神经元的培养，加入Aβ寡聚体，构建AD细胞模型。使用艾地苯醌预处理，检测相应线粒体功能的变化。同时设立对照组。
神经元培养至12-14天进行药物预处理。先采用不同浓度的艾地苯醌预处理进行细胞活力检测，根据结果选择合适的艾地苯醌药物浓度。实验分组如下:溶剂对照组、Aβ处理组、sAβ(Scrambleβ-Amyloidprotein)处理组、IDB处理组、IDB+Aβ处理组、IDB+sAβ处理组。进行细胞线粒体功能测定时，1μM艾地苯醌预处理4小时后按分组不同分别给予1μMAβ、或sAβ继续共同孵育24小时。
2.原代培养:取出生1天以内的C57BL/6j小鼠，分离大脑皮层，取皮层神经元进行原代培养，将神经元种植于含有NeurobasalA、B-27TM、谷氨酰胺成分的培养基中，置于37℃含5％CO2的细胞培养箱内。
3.Aβ及scrambleAβ的制备:Aβ1-42、sAβ冻干粉离心后，加入到HFIP中，摇匀，并超声水浴以充分溶解，离心后取上清液过夜干燥形成肽膜，用DMSO溶解肽膜，然后用BCA法测蛋白浓度。
4.细胞毒性试验检测:使用用MTT试剂盒，检测不同浓度的艾地苯醌预处理对神经元细胞的活力的影响。使用酶标仪检测在550nm波长的吸光值，使用Gene5软件(BioTek)进行分析。为实验选择合适的药物浓度。
5.线粒体产能功能检测:使用AbcamATP分析检测试剂盒，检测各实验组的ATP产生量;
6.线粒体膜电位的检测:使用TMRM染色法检测线粒体膜电位，按说明书步骤操作，TMRM的工作浓度为20nM，浓度为200nM的MitoTrackerGreen染色与TMRM染色同时进行，使用倒置荧光显微镜连接活细胞工作站照相，图像使用显微镜自带软件进行分析。
7.线粒体超氧化物的测定:使用MitoSoxred染色法检测线粒体超氧化物的产生;MitoSoxRed工作浓度为2μM，在倒置荧光显微镜下观察照相，使用尼康NIS高级软件对红色强度进行分析。
8.蛋白免疫印迹:使用WesternBlotting法来检测线粒体突触功能相关的神经元中PKA、CREB、pPKA、pCREB的表达水平，膜在Bio-RadChemidoc成像系统上成像。用Imagelab软件(Bio-Rad)对印迹进行分析。
9.统计分析:本研究中的定量数据使用均数±标准误表示。使用GraphPadPrism5软件进行统计分析。组间比较采用单因素方差分析和Bonferroniposthoc分析。P＜0.05差异有统计学意义。
研究结果:
1.艾地苯醌浓度在0到10μM范围内对神经元细胞活性没有影响。当浓度高至100μM时神经元活力受到显著影响。我们使用的是1μM的IDB对神经元进行处理并继续以后的检测。
2.艾地苯醌预处理能够保护原代神经元线粒体的氧化应激功能，抑制线粒体超氧化物的形成。没有艾地苯醌预处理的神经元在Aβ干预下，线粒体超氧化物产生明显增加，而是经过艾地苯醌预处理的神经元在Aβ干预下MitoSoxRed红色强度则与溶剂对照组强度相当。
3.艾地苯醌对线粒体的生物产能功能有保护作用。神经元在Aβ干预下ATP产生明显减少，而是使用艾地苯醌后ATP产生量与对照组无差异。线粒体膜电位检测与ATP结果一致。单独给予Aβ干预的神经元TMRM染色强度明显下降，而艾地苯醌预处理并Aβ干预的神经元细胞组则染色强度与对照组水平无差异。
4.在Aβ环境下，艾地苯醌对线粒体功能的保护作用有利于PKA-CREB信号传导。Aβ组出现磷酸化的PKA及磷酸化的CREB表达水平下降(P＜0.001)，而艾地苯醌预处理组表达水平则未有明显变化。艾地苯醌抑制了Aβ引起的PKA-CREB信号传导通路的失活。
研究结论:
在不造成细胞毒性的条件下，艾地苯醌预处理能够抑制Aβ介导的线粒体超氧化物的产生;能够保存Aβ干预下线粒体的生物产能功能;能够保护与突触功能相关的PKA-CREB信号传导通路免受Aβ干预的影响。艾地苯醌对原代神经元中Aβ介导的线粒体功能损伤有保护作用;
第二部分艾地苯醌对5xFAD小鼠保护作用的研究
研究目的:
1.探讨艾地苯醌预处理对AD模型小鼠空间学习记忆能力的影响;
2.探讨艾地苯醌预处理对AD模型小鼠线粒体产能功能的影响;
3.探讨艾地苯醌预处理对AD模型小鼠脑内Aβ表达量的影响;
4.探讨艾地苯醌预处理对AD模型小鼠脑内突触密度的影响
研究方法:
1.动物模型的药物处理和分组
分组:遗传背景相同的小鼠经基因型鉴定后分到4组:①5xFAD小鼠药物组(5xFAD-Idebenone);②5xFAD小鼠对照组(5xFAD-Vehicle);③非转基因小鼠药物组(nonTg-Idebenone);④非转基因小鼠对照组(nonTg-Vehicle)。以上小鼠自3月龄开始每日腹腔注射，小鼠每周称重，按体重调整剂量。观察月龄为4月龄、8月龄(分别模拟AD的中期、晚期阶段)。药物组艾地苯醌的用法用量为100mg/kg(艾地苯醌悬液0.01ml/g)腹腔注射，每日一次;对照组为5％阿拉伯胶0.01ml/g，每日一次。
2.水迷宫行为学检测:使用六臂水迷宫系统，检测4月龄、8月龄5xFAD小鼠及对照组小鼠的空间学习记忆能力。
3.组织线粒体产能功能ATP检测:使用AbcamATP分析检测试剂盒，检测各实验组的ATP产生量;
4.Aβ40、Aβ42表达量的检测:采用ELLSA法检测脑内Aβ40、Aβ42的水平，分别对4月龄、8月龄的5xFAD转基因小鼠进行检测。
5.组织切片制备及免疫荧光染色:制备脑组织切片，使用免疫荧光染色法检测脑内突触密度的变化。
研究结果:
1.艾地苯醌对5xFAD小鼠空间学习记忆能力有保护作用。4月龄及8月龄5xFAD小鼠均出现了空间学习记忆能力的下降，而药物组(5xFAD-Idbenone)空间学习记忆能力要优于对照组(5xFAD-Vehicle)，差异有统计学意义。
2.艾地苯醌对5xFAD小鼠线粒体产能功能有保护作用。8月龄5xFAD小鼠ATP产生量明显减少，但是艾地苯醌治疗组ATP产生量要高于对照组。4月龄中则无显著差异。
3.艾地苯醌影响5xFAD小鼠脑内Aβ的代谢。早期使用艾地苯醌未对4月龄5xFAD小鼠脑内Aβ40、Aβ42水平造成影响，但是8月龄5xFAD小鼠艾地苯醌治疗后脑内Aβ42下降。说明长期使用艾地苯醌可以影响5xFAD小鼠脑内Aβ42代谢。
4.艾地苯醌对5xFAD小鼠脑内突触密度有保护作用。我们对小鼠脑片进行vGlut1与PSD-95免疫荧光染色来确定突触数目，在共聚焦显微镜下观测。结果发现4月龄和8月龄的5xFAD小鼠，突触均出现明显减少;而接受艾地苯醌治疗的5xFAD小鼠海马CA1区中突触密度均明显高于对照组。
另外，在非转基因小鼠中，艾地苯醌治疗并未对小鼠的空间学习记忆能力、Aβ表达量、线粒体功能、突触造成影响。我们认为实验剂量的艾地苯醌在正常小鼠中使用是安全的。
研究结论:
艾地苯醌预处理能够改善AD模型小鼠(5xFAD)的空间学习记忆能力，对线粒体功能有一定的保护作用，能够减少5xFAD小鼠脑内的Aβ含量，对脑内的突触数目有保护作用。所以，AD早期阶段使用艾地苯醌对中晚期阶段5xFAD小鼠有保护作用。另外，实验剂量的艾地苯醌在正常小鼠中使用是安全的。
结论(全文):
1.在细胞水平，在不造成细胞毒性的条件下，艾地苯醌能够抑制Aβ介导的线粒体超氧化物的产生;能够保存Aβ干预下线粒体的生物产能功能;能够保护与突触功能相关的PKA-CREB信号传导通路免受Aβ干预的影响。艾地苯醌对原代神经元中Aβ介导的线粒体功能损伤有保护作用;
2.在AD动物模型中，AD早期阶段使用艾地苯醌对中晚期阶段5xFAD小鼠空间学习记忆能力、线粒体功能、突触数目有一定的保护作用，能够减少5xFAD小鼠脑内的Aβ含量。另外，实验剂量的艾地苯醌在正常小鼠中使用是安全的。
因此，使用艾地苯醌作为一种预防策略早期并长期使用，可能具有减低风险、减缓病程进展的潜力。