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目的:研究伤寒沙门菌耐药质粒pRST98与小鼠巨噬细胞J774A.1凋亡之间的关系,为进一步明确pRST98在沙门菌致病中的作用机制提供理论和实验依据。
方法:将伤寒沙门菌耐药质粒pR-ST98导入有成熟动物模型和遗传背景明确的鼠伤寒沙门菌低毒株RIA中,形成接合子pRST98/RIA,并用携带一分子量为100kb毒力质粒的鼠伤寒沙门菌标准毒株SR-11作阳性对照,RIA作阴性对照。为确定细菌与J774A.1共培养时阿米卡星(AMK)对胞外受试菌的抑菌、杀菌效果以及感染的最佳比例,首先进行了AMK对SR-11、pRST98/RIA和RIA的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)以及细菌与细胞感染复数(MOI)的测定,用以确定MOI和最佳观察时间。将以上3株菌在体外分别与小鼠巨噬细胞J774A.I共培养,于0h,2h,4h,6h,12h和24h用JC-1染色法和流式细胞术检测pRST98对J774A.1线粒体膜电位的影响;Annexin V-FITC试剂盒和TUNEL法检测J774A.I的凋亡情况;用MTT法检测细菌对细胞生长的抑制率,台盼蓝染色法和系列稀释法分别用于检测活细胞数和胞内活菌数。
结果:AMK对pRST98/RIA和RIA的MIC相同,均为10μg/ml,对SR-11的MIC为5μg/ml,对3株菌的MBC均为80μg/ml。3株菌在含100μg/ml的AMK培养基中2h后可被有效杀灭。细菌和细胞共培养3h,MOI为100:1时作用明显。细菌与细胞作用2h后起,SR-11组、pRST98/RIA组和RIA组J774A.1线粒体膜电位下降的百分率依次降低,随着感染时间延长J774A.1通过线粒体途径而导致的细胞凋亡率呈上升趋势;Annexin V-FITC试剂盒检测各感染组J774A.1的凋亡率表现为SR-11组>pRST98/RIA组>RIA组(P<0.05),TUNEL法检测J774A.1的凋亡情况表现为SR-11组最高,pRST98/RIA组高于RIA组;MTT法检测细菌对细胞生长的抑制率表现为SR-11>pRST98/RIA>RIA(P<0.01),各时间段J774A.1的活细胞数和细胞内活菌数均呈现SR.11组
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