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研究背景骨肉瘤是一种最常见的原发性骨恶性肿瘤,儿童和青少年的发病率较高,早期侵袭性转移会使骨肉瘤快速进展以及引起不良的预后,从而导致整体存活率较低。近年来,靶向治疗在骨肉瘤的治疗中显示出巨大的潜力,但仍需探索更有效的治疗靶标。长非编码核糖核酸（lncRNA）在癌症生物学中起着重要的作用,可以作为调节肿瘤转移的关键调节因子,也可以与miRNA作用直接或间接地调节目的蛋白的表达。然而,lncRNA在骨肉瘤中的作用仍需更多的探索和研究。特异AT序列结合蛋白2（SATB2）是一种DNA结合蛋白,可以特异性结合核基质附着区,并作为染色质高级结构域转录的调节剂,且与多种恶性肿瘤中与侵袭、转移和凋亡等过程相关。我们前期实验研究初步表明lncRNA-miRNA-mRNA网络调控与骨肉瘤之间存在着潜在联系,这为探讨骨肉瘤发生发展的分子机制提供了新的思路。本课题组拟对lncRNA XLOC-005950与miR-362-5p的靶向作用及miR-362-5p与靶基因SATB2的靶向作用对骨肉瘤侵袭、迁移和凋亡的调控及生物学性状的影响作进一步研究。研究目的本研究通过生物信息学软件预测lncRNA XLOC-005950和SATB2共同作用的miRNA,分别验证lncRNA XLOC-005950与miR-362-5p、miR-362-5p与SATB2的靶向作用。同时,检测正常成骨细胞hFOB1.19、骨肉瘤细胞系MG63和敲除lncRNA XLOC-005950的细胞系MG63-/-中lncRNA XLOC-005950、miR-362-5p和SATB2的表达量以及细胞生物学差异。通过MG63细胞转染miR-362-5p mimics验证miR-362-5p对靶基因的调控,及对细胞生物学性状的影响。从而对骨肉瘤的发生发展机制提供新的实验依据,寻找骨肉瘤新的防治靶点。研究方法1.采用生物信息学软件Diana Tools预测分析与lncRNA XLOC-005950结合的miRNA;用TargetScan,microRNA.org等生物信息学软件预测靶向SATB2的miRNA。2.本实验所用26例骨肉瘤患者组织及癌旁组织标本,来自2016年9月至2018年6月期间由郑州大学第一附属医院收集后保存于液氮。实时荧光定量PCR（qPCR）检测配对组织中lncRNA XLOC-005950、miR-362-5p和SATB2mRNA的表达量;Western blot检测SATB2蛋白的表达。3.RT-qPCR检测骨肉瘤细胞系MG63、敲除lncRNA XLOC-005950的骨肉瘤细胞系MG63-/-和正常成骨细胞hFOB1.19中lncRNA XLOC-005950、miR-362-5p和SATB2 mRNA的表达;Western blot检测三种细胞系中的SATB2蛋白的表达;CCK-8实验检测三种细胞系的增殖能力;Transwell实验检测三种细胞系的侵袭能力;划痕实验检测三种细胞系的迁移能力;流式细胞术Annexin V/PI检测三种细胞系的凋亡的情况。4.脂质体转染体外合成的miR-362-5p mimics和miR-362-5p negative control于MG63细胞中,并分为3组:miR-362-5p mimic组（脂质体转染miR-362-5p mimics）;NC组（脂质体转染miR-362-5p negative control）;Blank组（仅脂质体）。5.qPCR检测细胞转染效率。6.转染细胞检测:（1）CCK-8实验检测转染细胞的增殖能力;（2）Transwell实验及划痕实验分别检测转染细胞的侵袭能力和迁移能力;（3）流式细胞术Annexin V/PI双染检测转染细胞的凋亡情况;（4）RT-qPCR检测转染细胞中SATB2 mRNA和VEGF-B mRNA的表达,Western blot检测SATB2和VEGF-B蛋白的表达。7.分别构建pmirGLO-SATB2和p-GL3-promoter-lncRNA XLOC-005950的野生型和突变型重组载体,双荧光素酶报告实验分别验证lncRNA XLOC-005950与miR-362-5p及SATB2与miR-362-5p的匹配结合作用。研究结果1.骨肉瘤组织及癌旁组织检测,结果显示:lncRNA XLOC-005950、SATB2mRNA和蛋白在骨肉瘤组织中的表达量显著高于其在癌旁组织（P<0.01）;而miR-362-5p在骨肉瘤组织中的表达量低于其相应癌旁组织的表达（P<0.05）。2.骨肉瘤细胞系MG63、敲除lncRNA XLOC-005950的细胞系MG63-/-和正常成骨细胞hFOB1.19的检测,结果显示:lncRNA XLOC-005950及SATB2的mRNA和蛋白的表达在骨肉瘤细胞系MG63中高于敲除了lncRNA XLOC-005950的细胞系MG63-/-和正常人成骨细胞hFOB1.19的表达（P<0.01）;而miR-362-5p在MG63细胞中的表达量显著低于MG63-/-和hFOB1.19细胞的表达（P<0.05）。3.CCK-8实验检测结果显示,与MG63细胞相比,MG63-/-细胞的生长增殖能力下降（P<0.05）;Transwell和划痕实验结果分别显示,MG63-/-细胞的侵袭能力和迁移能力较MG63细胞相比均下降（P<0.05）;流式细胞术Annexin V/PI双染实验的结果显示,与MG63细胞相比,MG63-/-细胞的凋亡率增高（P<0.01）。4.qPCR检测转染效率显示,MG63转染miR-362-5p mimics成功。5.转染细胞检测结果:（1）CCK-8结果显示,与NC组和Blank组比较,miR-362-5p组细胞生长增殖能力下降（P<0.05）;（2）Transwell和划痕实验结果分别显示,与NC组和Blank组比较,miR-362-5p mimic组细胞侵袭能力和迁移能力均下降（P<0.05）;（3）流式细胞术Annexin V/PI双染实验显示,与NC组和Blank组比较,miR-362-5p组细胞凋亡率增高（P<0.01）;（4）qPCR结果显示,与NC组和Blank组比较,SATB2 mRNA（P<0.05）和VEGF-B mRNA（P<0.01）的表达量降低;Western blot结果同样显示SATB2和VEGF-B蛋白的表达下降。6.生物信息学分析预测lncRNA XLOC-005950与miR-362-5p及SATB2与miR-362-5p之间存在靶向作用的结合位点。双荧光素酶报告实验分别验证,其结果与生物信息学分析预测一致,表明三者之间存在靶向匹配的结合位点。结论1.骨肉瘤组织及骨肉瘤细胞MG63中,lncRNA XLOC-005950和SATB2与其相应的癌旁组织和正常成骨细胞hFOB1.19比较均高表达,miR-362-5p低表达。2.敲除lncRNA XLOC-005950的MG63-/-细胞及转染miR-362-5p过表达的MG63细胞中SATB2的表达降低,同时其两类细胞的增殖、侵袭、迁移能力降低且凋亡率增加。3.miR-362-5p可与SATB2的3’UTR区域特异性结合并抑制其表达,SATB2是miR-362-5p的靶基因;lncRNA XLOC-005950可与miR-362-5p特异性结合并起负调控作用。