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肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,我国肝癌死亡率高居世界之首。近数十年来,虽然在手术和放化疗等治疗方面取的了很大的进步,但其远期疗效仍不满意,主要原因是术后肿瘤的复发和转移。肝癌手术后5年复发率高达62%。因此,肝癌转移复发的研究现已成为目前肝癌防治工作中的重点。肝癌的转移是一个多环节,多阶段的过程。通过对肝癌患者原发灶和转移灶的对比研究发现,两者之间具有高度同源性,这提示我们,这部分引起转移的肿瘤细胞具有复制出和原发灶异质性相同的能力。
许多研究证实了肿瘤组织中并不是每个肿瘤细胞都具有致瘤性,而是由一部分比例极低的细胞增殖形成的,这部分细胞被称为肿瘤干细胞,并且认为肿瘤干细胞是导致肿瘤发生以及治疗后复发的“根源”。肿瘤干细胞具有:自我更新、分化潜能、高致瘤性、耐药性等生物学特性。
目前在对乳腺癌和胰腺癌的研究中发现,肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells)是引起肿瘤转移的重要原因。肝癌中肿瘤干细胞的研究才刚刚起步,目前认为,肝癌干细胞的来源可能为肝干细胞或肝祖细胞,即卵圆细胞。最近,一些研究人员利用肿瘤干细胞表面标志物CD133,从肝癌组织及肝癌细胞系中分离出具有干细胞特性的亚群,为肝癌干细胞的存在找到了新的证据。这些肝癌组织中CD133+细胞,不仅在体外具有很强的增殖和克隆形成能力,还在免疫缺陷鼠的体内具有明显的成瘤优势;同时,CD133+细胞具有较高的干细胞相关基因如catenin、Oct-3/4、Bmi、SMO、Notch-1的表达;在体外适当条件下培养,CD133+细胞能分化为血管内皮样,骨骼肌样或心肌样细胞。
人CD133蛋白为细胞膜蛋白超家族成员,为一个含有865个氨基酸、分子量约为120 ku的糖蛋白。其分子结构包括:细胞外NH2-端,2个大的胞外环状结构,5次跨膜结构域,2个小的富含半胱氨酸胞内环状结构和胞内的-COOH结构
本研究主要通过对CD133基因的提取及过表达的方法,研究CD133+肿瘤细胞增殖、致瘤性、耐药性及凋亡。研究发现在体外,CD133+肿瘤细胞具有更强的增殖能力,致瘤性及耐药性。进一步研究发现,过表达CD133的肿瘤细胞,其细胞内部PI3K-AKT被过度激活,从而导致了其增殖能力增强,凋亡减弱。综上,我们认为,肝癌中CD133+细胞具有肿瘤干细胞的特性,是肝癌转移复发的重要原因。靶向CD133+肝癌细胞将成为肝癌分子靶向治疗的一个新途径。
本文主要分为以下四个部分:
第一部分,通过收集肝癌细胞系进行筛选发现,并不是所有肝癌细胞系都表达CD133表面分子,其表达率高低不一。我们通过流式细胞仪检测后,选定Huh7和HepG2两株细胞。Huh7细胞株中CD133的表达率稳定在70%左右,HepG2细胞株中CD133的表达稳定在1%以内。通过提取Huh7细胞中CD133基因序列,构建真核细胞表达载体,转染入HepG2细胞系中,建立稳定表达CD133的HepG2细胞系(HepG2-CD133),另一组HepG2转染空质粒载体,并建立稳定转染细胞系(HepG2-EV)。
第二部分,通过对HepG2-CD133和HepG2-EV两株细胞的体外对比发现,CD133组的增殖,耐药能力增强。凋亡减弱。由此推断,CD133分子具有改变细胞增殖等生物学性状的能力,具有肿瘤干细胞的部分特性。
第三部分,对HepG2-CD133及HepG2-EV两株细胞的体外成瘤比较。通过对免疫缺陷鼠随机分为两组,分别皮下接种同一数量的HepG2-CD133及HepG2-EV两株细胞,观察记录瘤体大小,3周后将瘤体取出,分别测量大小,重量,进行比较。实验发现,HepG2-CD133组致瘤性明显强于HepG-EV组,主要表现在瘤体的生长速度方面。
第四部分,进行HepG2-CD133及HepG2-EV两株细胞分子信号通路的研究。分别提取两株细胞的蛋白,进行分子电泳及蛋白质印迹,观察分子信号通路的变化。HepG2-CD133与HepG2-EV对比发现,CD133组中的PI3K-AKT信号通路被过度激活。这可能是导致HepG-CD133细胞株增殖、致瘤增强,凋亡减弱的直接原因。
综上所述,越来越多的肿瘤干细胞研究中将CD133作为一个标志分子,而CD133的功能现在却不清楚。本研究通过过表达的方法,将CD133作为单一的影响因素进行分析,揭示CD133的生物学功能,发现CD133表面分子能使肿瘤细胞具有部分肿瘤干细胞特性,靶向CD133分子可能会成为肿瘤的分子靶向治疗的新途径。