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猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是一种重要的猪类传染病,能够引起猪群发生腹泻,并能导致哺乳仔猪因脱水而死亡。该病在欧洲、亚洲、北美洲广泛流行,给很多养殖场造成了毁灭性的打击和巨大的经济损失。针对目前PEDV不断变异的情况,本研究从临床病料中分离到3株PEDV流行毒株并进行遗传变异分析,制备了 PEDV单克隆抗体,鉴定了 3个PEDV N蛋白的抗原表位,为PEDV临床诊断和表位疫苗的研制奠定了基础。具体内容包括以下3个方面:1.猪流行性腹泻病毒的分离鉴定与遗传进化分析为了了解国内PEDV流行毒株的变异情况,本研究利用Vero细胞,从四川、江苏和上海暴发腹泻的猪场的猪小肠组织中分离获得3株PEDV野毒株,细胞培养物经RT-PCR鉴定为阳性后分别命名为MS株、YZ株和SH-A株。为了研究这三株病毒的遗传变异特性,对S、N、ORF3基因进行序列分析。遗传进化树显示,本实验室分离的三株PEDV属于G2b亚群(变异毒株),与中国BJ2011-1和越南HUA-14PED96毒株亲缘关系最近。基因序列分析表明,与近几年国内外分离到的变异毒株相比,三株分离毒株均在S基因新增了 16个氨基酸突变,引起了 S蛋白抗原表位和糖基化位点发生改变;在N基因新增了 2个氨基酸突变,同时,SH-A毒株N蛋白从399aa起连续缺失了 12个氨基酸;在ORF3基因新增了 4个氨基酸突变。本研究为PEDV流行毒株变异机理的研究及疫苗的研制、疾病的鉴别性诊断奠定了基础。2.猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的制备与鉴定用纯化的猪流行性腹泻病毒(CV777毒株)免疫BALB/c小鼠,将脾细胞与SP2/0细胞融合、间接ELISA方法筛选和亚克隆,制备获得3株能稳定分泌PEDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株3F10、3H8、3H10,并对抗体效价和亚型进行了鉴定。细胞培养上清ELISA抗体效价为1:1600～1:3200,腹水抗体效价达1:2×105;抗体亚型鉴定结果显示,3F10抗体属于IgG1,3H8和3H10属于IgG2b,轻链均为κ型。Western blot结果显示,3株单抗均能与PEDV CV777毒株和真核表达的N蛋白发生特异性反应。间接免疫荧光实验证明,3株单抗均能与PEDV CV777毒株和PEDV流行毒株MS株发生特异性反应。3.猪流行性腹泻病毒N蛋白抗原表位的鉴定为了对本实验室已获得的抗PEDV N蛋白的单克隆抗体针对的抗原表位进行定位。本研究利用原核表达系统截短表达PEDV N蛋白,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白成功表达后,再通过Western blot对抗PEDV N蛋白的单克隆抗体所识别的抗原表位进行定位。结果显示,单抗3F10识别抗原表位56QIRWRMRRGERI67;单抗 6A11 识别抗原表位 S318GYAQIASLAPNVAALLFGGNVAVRE342,单抗 1C9 识别抗原表位398HEEAIYDDV406;单抗3H8和3H10识别病毒的构象表位。将表位序列与不同来源的PEDV毒株进行序列比对分析,结果显示表位S318GYAQIASLAPNVAA LL FGGNVAVRE342在所参考毒株中高度保守;表位398HEEAIYDDV406和56QIRWRMRR GERI67在所参考毒株中较为保守。以上结果为PEDV N蛋白功能分析研究和PEDV诊断方法的建立奠定了基础。