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人类多种遗传病和肿瘤的发生均与细胞染色体非整倍性畸变相关。染色体分离行为主要由动粒(Kinetochore)和纺锤体检查点(Spindle assemble checkpoint, SAC)等功能结构和分子机制所调控。本研究将从kinetochore上DNA分子突变和蛋白复合物变异两个角度来探讨细胞非整性畸变的发生机制。Kinetochore位于染色体着丝粒区,是由着丝粒蛋白(CENPs)和α卫星DNA共同组成的三层盘状结构[1],是支持染色体分离的重要元件。在细胞分裂过程中,染色体的移动、姐妹染色单体分离都通过附着在kinetochore上的纺锤丝牵引来完成。Kinetochore的缺失或者其上的结构、成分发生变化,均可导致纺锤丝的附着失败或者附着不均一,进而引起染色体分离行为的异常。Kinetochore上的CENPs的功能一直受到人们的关注,CENPs表达或结构异常,将影响kinetochore的组装、激活、自我复制等,并对染色体的正常分离产生影响。CENP-B是着丝粒蛋白家庭中关键蛋白之一,它通过与着丝粒区α卫星DNA序列上特定的17bp序列(称为CENP-B框)结合而行使功能。已有研究证实:具有功能活性的着丝粒需要完整的CENP-B框与CENP-B蛋白结合,两者缺一不可,并且两者的结合能力对CENP-A、CENP-C和CENP-E在着丝粒的聚集起着主导作用。因此,结构完整的CENP-B框对于CENP-B蛋白行使其在kinetochore上的各种功能,以及kinetochore在细胞分裂中是否正常发挥其功效起着决定性的作用。通过特殊的银染色方法或抗着丝粒抗体间接免疫荧光技术,可以清晰显示染色体着丝粒区Kinetochore蛋白复合体(即kinetochore-CENPs复合体) [2] ,其结构和成分的变异匀可影响kinetochore的功能。现已证实Kinetochore蛋白复合体上蛋白分子(CENPs)缺乏是诱发染色体不分离的潜在根源[3]。本研究从染色体着丝粒区α卫星DNA上CENP-B框突变的角度,探索唐氏综合征患儿21号染色体不分离的分子基础。此外,利用kinetochore-NOR同步银染技术分析恶性肿瘤细胞(HEP-2、SW626)Kinetochore蛋白复合体变异,以探讨恶性肿瘤细胞染色体非整倍性畸变发生的原因。本实验将会为进一步探索细胞非整倍性畸变发生机制奠定理论和实验基础。第一部分Down’s患儿着丝粒区αI型卫星DNA和CENP-B框序列分析目的:分析Down’s患儿和正常儿童21号染色体着丝粒区αI型卫星DNA(Accession:D29750)上4个CENP-B框及其临近序列是否存在变异,以及这些变异是否与Down’s患儿21号染色体不分离存在一定关系。方法:提取150例Down’s患儿和100例正常儿童外周血DNA,分两段PCR扩增21号染色体着丝粒区αI型卫星序列(覆盖4个CENP-B框),所得产物采用专门设计的测序引物直接测序,并采用DNAssist 2.0软件与NCBI数据库上序列进行对比。结果:1.成功提取150例Down’s患儿和100例正常儿童外周血DNA,琼脂糖电泳和紫外分光光度计检测显示DNA片断完整,纯度高。2.完成21号染色体着丝粒区αI型卫星DNA的PCR分段扩增,琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物条带分明,无错误扩增片段。3.完成所有标本21号染色体着丝粒区αI型卫星DNA的分段测序,测序图谱上4个CENP-B框序列完整,清晰,无杂峰。4.所得结果与NCBI数据库对比分析发现:○1 Down’s患儿和正常儿童的CENP-B框序列高度保守;○2所有患者和正常人的αI型卫星DNA区段的部分位点和NCBI公布的标准序列存在差异,主要为:661位点C缺失,670位点T→G,1035和1036位点之间插入A,1076和1077位点之间插入C,1239位点A→T,1343位点T→C;○3在αI型卫星DNA上发现大量国内外尚未见报道的SNPs位点。结论:1.染色体着丝粒区αI型卫星DNA是一类高度重复的非编码序列,这类高度重复的非编码序列对维持DNA序列保守起到了保护作用。虽然体外实验证实,人工合成带有突变的CENP-B框不能与CENP-B蛋白结合而影响动粒蛋白复合体的形成,但我们在中国人群Down’s患儿和正常儿童染色体着丝粒区的CENP-B框匀未检测到DNA突变,这表明这类高度重复的非编码序列的存在能够有效抑制CENP-B框DNA突变而预防染色体非整倍性畸变的发生。因此,我们认为人类Down’s患儿21号染色体不分离的分子基础可能不涉及CENP-B框DNA突变。2.我们在中国人的αI类卫星DNA区段检出了多个与NCBI数据库公布的标准序列不一致的位点,这可能与种族差异有关。此外,我们还在αI类卫星DNA上发现大量尚未见报道的SNPs位点,这些SNPs的意义何在,尚不清楚。第二部分HEP-2和SW626肿瘤细胞染色体Kinetochore蛋白复合体变异的研究目的:分析HEP-2和SW626两种恶性肿瘤细胞染色体Kinetochore蛋白复合体变异情况,以探讨染色体非整倍体畸变的发生原因。方法:采用改良的kinetochore-NOR同步银染技术分析HEP-2细胞和SW626细胞染色体Kinetochore蛋白复合体变异,正常健康人外周血细胞作为对照,恶性肿瘤细胞与正常健康人外周血细胞Kinetochore蛋白复合体变异比较分析采用卡方检验。结果:1.分析HEP-2细胞株染色体分裂相308个,共计染色体16962条:检出kinetochore缺失染色体146条、kinetochore-NOR融合染色体105条、kinetochore迟滞复制染色体78条、不对称kinetochore染色体38条、多重kinetochore染色体18条。2.分析SW626细胞株染色体分裂相334个,共计染色体12092条:检出kinetochore缺失染色体325条、kinetochore-NOR融合染色体243条、不对称kinetochore染色体15条、多重kinetochore染色体8条、kinetochore迟滞复制染色体28条。3.分析正常人外周血淋巴细胞分裂相367个,共计染色体16882条:检出kinetochore缺失染色体42条、kinetochore-NOR融合染色体85条、不对称kinetochore染色体4条、kinetochore迟滞复制染色体29条。4.统计分析表明:与正常健康人外周血细胞比较,○1 HEP-2细胞染色体kinetochore缺失、kinetochore迟滞复制、不对称kinetochore和多重kinetochore发生率显著升高(P<0.01),kinetochore-NOR融合率二者之间没有显著差异(P >0.05);○2 SW6262细胞染色体kinetochore缺失、kinetochore-NOR融合不对称、kinetochore和多重kinetochore发生率显著升高(P<0.01),kinetochore迟滞复制二者之间没有显著差异(P >0.05)。结论:1. HEP-2和SW626细胞染色体的Kinetochore蛋白复合体均存在不同程度的变异,这种变异可能是肿瘤细胞染色体非整倍性畸变的潜在根源。2.○1 HEP-2细胞染色体非整倍性突变可能源于kinetochore缺失、kinetochore迟滞复制、不对称kinetochore和多重kinetochore;○2 SW626细胞染色体非整倍性突变可能源于染色体kinetochore缺失和kinetochore-NOR融合、不对称kinetochore和多重kinetochore。3.多重kinetochore可能是诱发肿瘤细胞染色体结构畸变产生的一种新的途径。