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超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)是生物抗氧化系统中重要的组成部分,主要用于清除体内多余的活性氧自由基,以保护机体遗传物质的完整性、细胞膜的稳定性等。水生动物由于缺乏特异性免疫,其自身天然免疫十分重要。近年来,大量研究证实SOD参与水生动物抗氧化反应。淇河鲫(Qihe crucian carp Carassius auratus)是河南省特有珍贵水产品,拥有很高的营养价值和经济价值,因此研究淇河鲫SOD基因特征及对病原菌的表达响应对于理解SOD的生物学功能具有重要意义。本研究以淇河鲫为研究对象,以淇河鲫肌肉总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增出Cu Zn SOD和Mn SOD的c DNA全长序列;采用q PCR技术分别检测了Cu Zn SOD和Mn SOD在健康淇河鲫10种器官组织中的表达情况;探究嗜水气单胞菌和LPS分别处理后淇河鲫肝、鳃、肾、脾和头肾中的表达响应;同时,采用羟胺法测定了相应酶活性变化。这些研究对于理解鱼体的抗氧化防护机制有重要意义,并为淇河鲫疾病防控提供理论依据。基于已知序列,设计引物,分别扩增淇河鲫Cu Zn SOD和Mn SOD的中间保守序列、3’端和5’端序列,经拼接后分别获得759bp和960bp两条c DNA全长序列。淇河鲫Cu Zn SOD的开放阅读框(ORF)长465 bp,编码154个氨基酸。预测淇河鲫Cu Zn SOD的分子质量为16.11KD,理论等电点为5.95。活性中心中,Cu2+结合位点为:His-47、-49,-64、-121,Zn2+结合位点为:His-64、-72、-81、Asp-84。两个Cu Zn SOD的家族标签序列:45GFHVHAFGDNT55、139GNAGGRLACGVI150。两个糖基化位点:N16、N69。此外,两个半胱氨酸C58和C147形成一个二硫键。且淇河鲫Cu Zn SOD无跨膜区与信号肽,是一种胞质Cu Zn SOD。淇河鲫Mn SOD的ORF框共675bp,编码224个氨基酸。预测其分子质量为24.87KD,理论等电点为8.28。活性中心的Mn2+结合位点为:His-52、-100、Asp-185、His-189。一个Mn SOD的家族标签序列:185DVWEHAYY192。在序列前端有26bp的线粒体靶向序列(Mitochondrial Targeting Sequence,MTS):1MLCRVGYVRRCAATLNPILGAVASKQ26。分别将两个基因的氨基酸序列在NCBI中进行BLAST比对,发现它们在不同物种中都有很强的保守性。构建系统进化树发现,淇河鲫Cu Zn SOD聚于鱼类胞质Cu Zn SOD的分支中,而淇河鲫Mn SOD聚于鱼类线粒体Mn SOD的分支中。采用q PCR技术检测淇河鲫鱼10种器官组织(肝、心、肌肉、脾、肠、皮肤、头肾、脑、肾和鳃)中Cu Zn SOD和Mn SOD的m RNA表达水平。结果显示Cu Zn SOD和Mn SOD基因在各器官组织中均有表达,且其表大量存在着差异。其中,肝中表达量最大。Cu Zn SOD m RNA在心、肌肉、脾、肠、皮肤、头肾、脑、肾和鳃中的表达量依次减少。而Mn SOD m RNA表达量有所不同,在肌肉、心脏、肠、肾脏、鳃、脑、脾和皮肤中依次减少。用嗜水气单胞菌和LPS对淇河鲫鱼进行攻毒实验,用q PCR技术检测肝、鳃、肾、脾、头肾中Cu Zn SOD和Mn SOD的m RNA在0 h、3 h、6 h、12 h、24 h及48 h六个时间点的表达变化;分别检测这五种组织中SOD在各个时间点的酶活性。结果显示,经嗜水气单胞菌和LPS处理后,Cu Zn SOD和Mn SOD基因在各器官组织中的表达在特定的时间点有响应,其变化趋势大多呈现为:表达量先上调,后下降,其中在脾和肾中出现了再次上升的现象。头肾与其他组织不同,呈现为先下降,随后上升的趋势。各组织中总SOD活性在各时间点的变化与m RNA的表达变化相似。表明淇河鲫Cu Zn SOD和Mn SOD可能被诱导表达以在抗病原菌感染的免疫反应中起着重要作用。结论:1.扩增得到淇河鲫Cu Zn SOD和Mn SOD基因的c DNA全长。其中Cu Zn SOD c DNA全长759bp编码154个氨基酸;Mn SOD c DNA全长960bp,编码224个氨基酸。2.在嗜水气单胞菌和LPS处理后,淇河鲫Cu Zn SOD和Mn SOD在器官组织中的表达和酶活与对照组相比在特定的时间点有响应,表明淇河鲫Cu Zn SOD和Mn SOD可能在淇河鲫抗病原菌感染的免疫反应中起着重要作用。