新近研究结果表明,胰岛素是中枢神经系统内重要的神经元存活和代谢的调节因子,具有神经营养作用,在促进神经元蛋白质合成、出芽生长以及神经突触的形成,维持脑内神经元的生长、存活、分化等方面发挥重要作用。研究显示中枢的胰岛素一方面来自外周,即胰岛合成的胰岛素通过血脑屏障进入中枢；另一方面来自神经元自身合成,这些由神经细胞合成的胰岛素也参与神经细胞的信号转导,发挥对神经细胞的代谢和功能调节作用。胰岛素受体密集地分布在海马CA1区的锥体细胞轴突、下丘脑肾上腺素能神经元末端及嗅球的树—树突触小体的细胞膜表面,同时在其他与认知密切相关的皮质脑区表达丰富。胰岛素通过与细胞膜上的胰岛素受体(IR)相结合,通过胰岛素信号转导过程激发细胞内特定的生理生化反应。阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)是一种常见的以进行性记忆减退、认知障碍为主要临床表现的中枢神经系统退行性疾病,主要的病理改变以大脑皮层和海马等脑区的神经细胞外老年斑形成、神经细胞内出现神经纤维缠结、神经突触的丢失和神经元大量死亡为特征。研究证实,糖代谢紊乱和AD发病机制有密切的联系,尤其在晚发性AD中,糖代谢紊乱可能是重要的始动因子。多种证据显示脑内糖代谢障碍可以引起认知功能受损,同时中枢的胆碱能系统功能下降,而后者与记忆功能关系密切,而且也是AD病理损伤的重要靶点。而认知功能障碍为主的AD常伴有脑内糖代谢障碍。此外AD发病的关键因素Aβ的产生及分泌与糖代谢障碍之间有非常密切的关联,并且可以相互促进。由于糖代谢紊乱(糖尿病)与AD间有着非常密切的联系,有可能存在同样的发病因素和病理过程,因而有专家提出AD可能是一种大脑特异的神经内分泌疾病或者称“3型糖尿病”。STZ是一种烷基化物,腹腔注射可通过破坏胰腺β细胞引起糖尿病,是公认的制作糖尿病模型的工具药,用来分析糖尿病的病理过程。然而在STZ诱导的糖尿病的模型中,观察到神经损伤及AD样的病理变化如Aβ的形成,Tau蛋白的过度磷酸化以及认知的障碍。进一步研究发现脑室注射STZ可以导致正常大鼠出现AD样的神经退行性变化,如线粒体功能异常、神经元死亡、学习记忆与认知功能障碍等。其机制可能是消弱或破坏胰岛素的信号转导,破坏胰岛素受体的自身磷酸化和内在酪氨酸激酶活性,增加磷酸化酪氨酸磷酸酶的活性。导致胰岛素信号通路障碍,引起脑持久的葡萄糖代谢紊乱和正常的能量生成受阻,海马乙酰胆碱转移酶活性降低,引起氧化应激反应,学习记忆能力下降以及认知功能障碍。在整体动物实验条件下包括腹腔注射及脑室注射STZ可以干扰胰岛素的信号转导系统,引起糖代谢紊乱,同时引起神经损伤及形成AD样的退行性病变,那么在离体培养的神经细胞STZ是否可引起同样的神经损伤?吡格列酮(Pioglitazone)属于噻唑烷二酮(thiazolidinedione, TZD)类胰岛素增敏剂,主要通过结合和活化过氧化物酶体增殖物激活的受体γ(peroxisome proliferatorsactivated recep tors, PPARs)而增强细胞对胰岛素作用的敏感性。吡格列酮对侧脑室注射STZ的大鼠的空间记忆力和海马的突触结构和神经元的受损有保护作用。而同样属于噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂的罗格列酮对散发性老年痴呆大鼠学习记忆功能有明显的改善作用。De la Monte等研究发现噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂可能对AD有预防治疗的作用。那么噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂吡格列酮是否对STZ诱导的皮层神经细胞损伤也有保护作用?HN是在AD患者大脑内发现的由24个氨基酸组成的线性多肽,能够有效抑制多种FAD(Family Alzheimer’s disease)基因突变和Aβ衍生物诱发的神经毒作用,初始被认为是AD特异性或AD相关毒性的神经保护肽。HN可抑制APP, PS1, PS2突变诱发的神经元死亡,拮抗Aβ完整肽链以及Aβ片断诱导的神经毒作用,但其作用机制还不清楚。随着科学研究的逐步深入以及我们实验室的研究发现,HN可以拮抗NMDA所致的兴奋毒,拮抗缺氧所致的皮层神经元损伤,拮抗OA通过诱导tau蛋白过度磷酸化所致的神经毒。提示HN具有广泛的神经保护作用,那么HN是否对STZ的神经损伤有保护作用?基于以上分析,本实验分三部分,第一部分是观察STZ对培养皮层神经细胞的损伤作用(包括乳酸脱氢酶,CCK-8和Calcein-AM染色)；第二部分是观察吡格列酮对STZ诱导的培养皮层神经细胞损伤的保护作用；第三部分是HN对STZ诱导的培养皮层神经细胞损伤的保护作用。第一部分STZ对培养皮层神经细胞的损伤作用本实验应用离体原代培养皮层神经细胞的方法,培养到第8天时,加入不同浓度的STZ溶液(1μmol/L,10μmol/L,100μmol/L,1000μmol/L)和胰岛素(15U／mL)。36小时后观察细胞的活力以及活细胞数目(乳酸脱氢酶、CCK-8和Calcein-AM染色)。结果显示：(1)细胞活力检测(cck-8),加入STZ36小时后,胰岛素组与空白对照组相比细胞活力无统计学意义；与对照组相比,STZ(1μmol/L)和STZ(10μmol/L)组细胞活力分别下降18.88%和27.74%(P＜0.05, n=4); STZ(100μmol/L)和STZ(1000μmol/L)细胞活力分别下降37.09%和40.88%(P<0.01,n=4)；(2) Calcein-AM染色,胰岛素组与空白对照组比较活细胞的数量没有明显变化,STZ(1μmol/L)和STZ(10μmol/L)处理后,活细胞的数量减少,伴有突触数量的减少；STZ(100μmol/L)和STZ(1000μmol/L)处理后,活细胞的数量明显减少,而且突触数目明显减少,许多神经细胞变成球性,没有突触；(3)乳酸脱氢酶(LDH)释放的检测,胰岛素组与空白对照组比较LDH的释放没有明显变化,STZ(1μmol/L)的释放量比对照组的释放增加25.23%(P＜0.05, n=4),STZ(10μmol/L)、STZ(100μmol/L)和STZ(1000μmol/L)的释放量比对照组的明显增加,分别增加35.66%、46.87%、50.52%(P<0.01,n=4)。第二部分吡格列酮对STz诱导的培养皮层神经细胞损伤的保护作用在前期的实验基础上,选用STZ100μmol/L作为实验剂量,进行后续的保护作用观察包括毗格列酮和HN。此外,由于胰岛素组和空白对照组无统计学差异,因此在后续的实验中我们将胰岛素作为常规因素加入到培养液中。在吡格列酮作用的实验中观察发现：(1)CCK-8的测定,在神经细胞培养到第7天时,加入不同浓度的吡格列酮和胰岛素,24小时后加STZ(100μmol/L),36小时后观察神经细胞的活力变化。STZ组与对照组比较,细胞活力明显下降,STZ组由对照组的100%降至63.93%(P<0.01,n=4)；提前24小时加入吡格列酮(0.01μmol/L)细胞活力升高了12.83%(P<0.01,n=4)；吡格列酮(0.1μmol/L)细胞活力升高了6.06%(P<0.05,n=4)；吡格列酮(1μmol/L)不能抑制STZ引起的细胞活力下降(P>0.05)。(2) Calcein-AM染色,STZ处理后,活细胞的数量明显减少,伴有突起数目明显减少；提前加入吡格列酮(0.01μmol/L)明显抑制STZ引起的活细胞数目减少,突起数目明显增加；吡格列酮(0.1μmol/L)抑制STZ引起的活细胞数目减少,突起数目增加；吡格列酮(1μmol/L)不能抑制STZ引起的活细胞数目减少。(3)LDH释放的检测,STZ组与对照组比较,LDH的含量明显增加,释放量增加42.31%(P<0.01,n=4)；吡格列酮(0.01μmol/L)可以降低由STZ引起的细胞损伤,使LDH的释放减少14.46%(P<0.01,n=4)；吡格列酮(0.1μmol/L)可以降低STZ引起的细胞损伤,使LDH的释放减少10.04%(P<0.05,n=4)；吡格列酮(1μmol/L)不能抑制STZ引起的细胞损伤。第三部分HN对STz诱导的培养皮层神经细胞损伤的保护作用在前期的实验基础上,观察HN对STZ诱导的培养的皮层神经细胞损伤是否有保护作用,STZ继续选用100μmol/L。结果显示：(1)CCK-8的测定,在神经细胞培养到第7天时,加入不同浓度的HN (0.1μmol/L,1μmol/L,10μmol/L,100μmol/L)和胰岛素,16小时后加入STZ(100μmol/L),36小时后观察神经细胞的活力变化。STZ组与对照组比较,细胞活力明显下降,STZ组由对照组的100%降至45.56%(P<0.01,n=4)；HN (0.1μmol/L)不能抑制STZ引起的细胞活力下降(P>0.05)；HN (1μmol/L)可以拮抗由STZ引起的细胞损伤,细胞活力升高28.47%(P<0.05,n=4)；HN (10μmol/L,100μmol/L)细胞活力升高48.47%、53.04%(P<0.01,n=4)。(2) Calcein-AM染色,提前加入HN(0.1μmol/L)不能抑制STZ引起的活细胞数目减少；提前加入HN(1μmol/L)可以减少STZ引起的活细胞数目减少,同时突触的数目有所增加,HN(10μmol/L,100μmol/L)明显抑制STZ引起的活细胞数目减少,而且突触的数目更加明显。(3)LDH释放的检测,STZ组与对照组比较,LDH的含量明显增加,释放量增加52.75%(P<0.01,n=4)；HN(0.1μmol/L)不能抑制STZ引起的细胞损伤,使LDH的释放减少9.36%(P>0.05,n=4)；HN (1μmol/L)可以降低由STZ引起的细胞损伤,使LDH的释放减少18.76%(P<0.05,n=4)；HN (10μmol/L,100μmol/L)可以明显降低由STZ引起的细胞损伤,使LDH的释放减少21.05%和23.65%(P<0.01,n=4)结论：1.STZ对离体培养的神经细胞具有类似脑室注射同样的神经损伤作用。2.吡格列酮可拮抗STZ诱导的培养神经细胞损伤,发挥神经保护作用。3.HN可拮抗STZ诱导的培养神经细胞损伤,发挥神经保护作用。