骨肉瘤是人类最常见的原发性恶性骨肿瘤，最常见于20—30岁的青年人。临床治疗困难，单纯截肢治疗患者常常在一年内死于肺转移。随着外科技术、影像学、化疗放疗的发展，患者长期生存率从10—20％上升到60—70％。但诸如肿瘤转移、复发等问题仍然没有得到完全解决。 研究表明，肿瘤细胞凋亡的减少与肿瘤的发生、发展的密切相关。并且使细胞耐受放疗、化疗的刺激。因而，诱导肿瘤细胞凋亡成为了一种新的杀伤肿瘤细胞的治疗策略。survivin定位于17q25，是一个凋亡抑制基因，属于IAP家族。它编码142氨基酸贱基16.5KD的胞浆蛋白。survivin具有抑制细胞凋亡和调节细胞分裂的双重功能。它抑制凋亡的作用是通过与凋亡效应分子caspase3、7直接结合实现的。所以可以抑制Fas、Bax、caspase分子和抗肿瘤药物引起的凋亡。survivin主要表达在细胞周期的G2／M期，结合与有丝分裂期的微管，不仅参与细胞浆分裂，而且参与细胞有丝分裂的其它诸多方面。分析其表达谱发现，survivin在胚胎和几乎所有的肿瘤组织中表达，但很少见于正常成人组织。在对某些肿瘤的临床研究中，survivin已成为诊断和评价预后的标志物。由于它特异性的表达与促进肿瘤生长的功能，使之成为肿瘤治疗的新靶点。 第四军医大学博士学位论文 研究目的:研究survivin在骨肉瘤中的表达，并观察人骨肉瘤细胞MG63中反义RNA和siRNA对survivin表达的抑制作用。 研究方法:1.对74例骨肉瘤患者的临床病理资料进行回顾性分析。应用survivin的抗体对上述患者的肿瘤组织切片进行免疫组织化学染色并进行统计学分析。2.培养骨肉瘤细胞MG63，采用Rl飞PCR的方法克隆人survivin基因编码区。DNA。构建survivin的反义诱导表达载体。转染MG63细胞，G418筛选稳定转染的细胞系。稳定转染的细胞系，以120林mol/l Znso;诱导，进行HE染色、survivin免疫细胞化学染色，透射电镜等形态学观察。同时绘制生长曲线。RT.PCR检测各组细胞survivin的表达。AnnexinV法检测细胞凋亡。3.应用psileneer 3.0一HI neo，构建survivin特异性的RNA干涉载体，转染MG63细胞，G418筛选稳定转染的细胞系。对各组细胞进行HE染色、透射电镜等形态学观察。应用RT一PCR、间接免疫荧光法、western blot分别检测survivin的mRNA和蛋白的水平变化。流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期变化。MTT法检测顺铂对细胞的杀伤作用。最后，进行裸鼠体内成瘤实验。 研究结果:1:74例标本中58例为阳性，总阳性率为78.4%。survivin的表达与患者年龄、性别、骨肉瘤亚型无明显关系。但与Enneking外科分期有关，I一IIA与IIB一川之I司，肿瘤survivin表达率差异明显(P<0.05)。2:采用Rl’- PCR从MG63细胞mRNA中扩增了survivin编码区eDNA，约42obp，纯化后克隆到puelg刀amHI和EcoRI位点中，测序正确。之后又反向克隆到pMDNA3中，构建了pMDNA3一anti一survivin重组质粒。转染MG63细胞，G4ls1000林g/ml筛选4周后，建成稳定转染细胞系。通过ZnSO;120林mol八诱导，可见MG63zpMDNA3一anti一survivin细胞出现凋亡。电子显微镜观察表明，部分细胞膜表面微绒毛消失，细胞膜表面出泡，染色体凝集。与同时期转染空载体组相比，转染第四军医大学博士学位论文pMDNA3一anti一survivin组细胞数量减少。半定量PCR检测显示诱导后survivin mRNA明显减少，免疫细胞化学染色可见诱导后的Mo63/pMDNA3一anti一survivin survivin蛋白表达明显降低。经流式细胞仪检测后发现，pMDNA3一anti一survivin细胞，在Znso;诱导4sh后凋亡率达到11%。较对照组细胞凋亡率高出3倍。3:根据survivin核普酸序列设计两对survivin特异的 RNA干涉片段PsvA和PsvB，退火后克隆到psileneer 3.0一HI neo BamHI和Hind 111酶切位点之间。测序正确。将阴性对照质粒、PsvA和PsvB分别转染MG63细胞，G4 1 8 1000拼g/ml筛选，约4一6周后建成稳定细胞系。细胞形态观察发现，MG63用svB部分细胞变得较大，而扁平，并失去短梭形的特点。其它细胞形态上未见明显变化。与正常MG63细胞、阴性对照细胞和MG63用svA相比，MG63用svB生长曲线则十分平缓，0.5 xl护细胞接种于6孔板，7天后细胞计数只能到达2.6 x 10，细胞，与其余3种细胞则为8xl护左右，存在显著差异(P<0.01)。共聚焦显微镜观察，阴性对照细胞、MG63用svA与正常MG63细胞survivin荧光信号主要位于胞浆中，呈弥散状分布，信号较强，而MG63用svB，基本上见不到绿色荧光信号。四种细胞RNA经RT-PCR，正常MG63、阴性对照细胞和MG63/P svA均有约420bp特异的survivin DNA条带，强度基本一致，MG63/PsvB仅有非常微弱的条带。四组PCR样品均有约SOObp大小的强度一致的卜actin片段出现。四种细胞裂解后各100 09蛋白样品，经巧%sDS一队GE电泳，western blot显示正常MG63、阴性对照细胞和MG63中svA三者survivin蛋白条带(约1 6.SKD)明显存在，且基本一致。而MG63/PsvB同样位置的条带基本消失。正常MG63、阴性对照细胞和MG63/P svA细胞周期变化不大，而MG63/PsvB Gl明显抬高达到74.2%，下降达到