全球有5%～8%人口患有自身免疫性疾病,临床治疗药物特异性差,毒副作用大,价格昂贵。天然产物具有来源丰富,副作用小等优点,近年来受到研究人员的广泛关注。落新妇苷是从土茯苓中分离得到的天然二氢黄酮醇苷类化合物,具有显著的免疫抑制、抗氧化、抗癌、抗糖尿病等多种药理活性。落新妇苷能选择性抑制活化的T细胞而不影响正常的T细胞和体液免疫,比治疗自身免疫疾病临床药物更具有选择性,毒性更低。作为黄酮类化合物和落新妇苷结构的优势骨架5,7-二羟基色原酮也具有抗炎及免疫抑制等多种药理活性。落新妇苷生物利用度仅为0.066%,大大限制其临床应用;同时构效关系研究不充分,导致该品种开发滞后。本文以落新妇苷以及其优势骨架5,7-二羟基色原酮作为先导化合物进行化学结构修饰,基于前药原理设计合成其衍生物以提高水溶性,改善其药代动力学性质,增加口服生物利用度;通过生物活性评价以及计算机虚拟对接,研究落新妇苷构效关系,为筛选成药性良好的临床候选药物提供基础。(一)化学合成本文同时采用半合成和全合成两种方法,在落新妇苷母核上引入糖基片段以及全合成落新妇苷优势骨架5,7-二羟基色原酮并对其进行糖苷化修饰。运用半合成的方法,以落新妇苷为起始原料,在乙酸酐和DMAP作用下,得到全乙酰化落新妇苷(AB-Ⅰ-1),收率为73.8%;根据落新妇苷母核上羟基反应活性差异,选择性脱除保护基,得到全乙酰化落新妇苷C-7位羟基衍生物(AB-Ⅰ-2),收率为73.8%;将AB-Ⅰ-2分别与Bz-Br-GL、Bz-Br-GA、Bz-Br-AB、Bz-Br-MA等糖基供体,在碳酸银作催化剂的条件下进行糖苷化反应,合成了C-7位糖苷化产物:AB-Ⅰ-3-GL,收率57.1%;AB-Ⅰ-3-GA,收率60.3%;AB-Ⅰ-3-AB,收率52.5%;AB-Ⅰ-3-MA,收率59.7%。将上述糖苷化产物在叔丁醇钾-甲醇条件下脱保护合成落新妇苷C-7位葡萄糖苷衍生物AB-Ⅰ-4-GL,收率52.1%;落新妇苷C-7位半乳糖苷衍生物AB-Ⅰ-4-GA,收率41.8%;落新妇苷C-7位阿拉伯糖苷衍生物AB-Ⅰ-4-AB,收率59.8%;落新妇苷C-7位甘露糖苷衍生物AB-Ⅰ-4-MA,收率47.2%。运用全合成的方法,以2,4,6-三羟基苯乙酮为起始原料,2,4,6-三氯-1,3,5-三嗪(TCT)和三氟化硼乙醚溶液作用下,得到5,7-二羟基色原酮骨架(CM-1);选择苄溴在碳酸钾/碘化钾条件下保护C-5位和C-7位羟基,得到5,7-二苄氧基色原酮骨架(CM-2),两步收率为35.5%;碘苯二乙酸氧化双键得到C-3位羟基色原酮骨架5,7-二苄氧基-3-羟基色原酮(CM-3),收率为68.29%;C-3位羟基与Bz-Br-Rh糖基供体在三氟甲烷磺酸银条件下进行糖苷化反应得到C-3位鼠李糖苷关键中间体5,7-二苄氧基-3-O-鼠李糖色原酮(CM-4),收率为18.9%,然后分别合成目标物CM-5’和CM-7。叔丁醇钾-甲醇体系下脱去CM-4的全部保护基后得到5,7-二羟基-3-O-鼠李糖色原酮(CM-5’),收率为25.5%。首先脱去CM-4的酚羟基保护基,然后选择性在C-7位与Bz-TCA-Rh糖基供体进行糖苷化反应,得到5-羟基-3,7-O-二全苯甲酰化保护鼠李糖色原酮衍生物(CM-6),收率为38.1%;最后在叔丁醇钾-甲醇体系下脱去全部保护基得到5-羟基-3,7-O-二鼠李糖色原酮衍生物(CM-7),收率为54.9%。(二)药理实验本文采用迟发性超敏反应小鼠模型,通过小鼠耳肿胀率、胸腺指数、脾重指数,以及小鼠血浆中MMP-2、MMP-9、TNF-α、IL-10含量等多项指标评价落新妇苷衍生物免疫抑制活性;最后通过与人源MMP-2、MMP-9蛋白进行计算机虚拟对接从分子层面验证落新妇苷及其衍生物作用机制。AB-Ⅰ-4-GL、CM-5’、CM-7均能显著降低致敏后耳肿胀率水平、基质金属蛋白酶含量、肿瘤坏死因子-α含量以及增加IL-10表达。AB-Ⅰ-4-GL、CM-5’、CM-7耳肿胀率抑制效果优于落新妇苷组,结合水溶性实验结果,落新妇苷衍生物药理活性提高可能与水溶性提高,导致其生物利用度增加有关,但略差于地塞米松组。从脾重指数、胸腺指数结果来看,相较于地塞米松组,落新妇苷衍生物毒性降低,适合长期服用。(三)构效关系研究(1)落新妇苷母核进行葡萄糖基片段修饰可以提高水溶性以及药理活性,从分子水平来看,可能与IL-10水平的提高以及MMP-9抑制效果的提高有关;(2)CM-1不具有免疫抑制活性,CM-5’活性优于落新妇苷,说明鼠李糖基片段的存在对于免疫抑制活性十分重要;(3)去除B环能提高水溶性以及药理活性,从分子水平来看,可能与TNF-α含量降低有关;(4)CM-7药理活性略差于CM-5’,但脾重指数略高,毒性相对较小;从分子水平来看,可能与IL-10水平的提高以及MMP-2抑制效果的提高有关。