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实验目的
病理性瘢痕是创伤过度愈合的表现,分为增生性瘢痕和瘢痕疙瘩。增生性瘢痕与瘢痕疙瘩两者都是以成纤维细胞为主的细胞增殖、活性增强,产生大量的胶原蛋白,使Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的细胞外基质(extracellar matrix,ECM)成分在组织中大量沉积,而难以被机体吸收或重塑的病理状态。许多因素导致病理性瘢痕的形成,由于肿瘤发生的基因研究的进展,其研究不仅局限于肿瘤学,而且部分癌基因在创伤修复、组织再生等过程中常被激活,并在病理性瘢痕中呈现高表达,被认为与病理性瘢痕形成有密切关系。本文通过免疫组织化学法观察p53基因和c-myc基因在病理性瘢痕中的表达,探讨两者在病理性瘢痕形成中所发挥的作用,为临床治疗及预防病理性瘢痕的发生提供分子生物学依据。
实验方法
选用手术切除后弃用的病理性瘢痕36例,作为实验组,根据临床表现及病理性质将其进行分组,其中包括瘢痕疙瘩A组12例,增生性瘢痕增生期B组12例,增生性瘢痕成熟期C组12例。选取浅表性瘢痕及正常皮肤各12例,分别设为D组、E组12例。标本进行石蜡包埋制作蜡块,切片厚度为3μm。每例切4张,一张做HE染色,两张做免疫组织化学染色,一张用于阴性对照。常规脱蜡至水,以3%双氧水消除内源性过氧化酶氧化物酶活性,高压修复1.5min,山羊血清阻断非特异性抗原孵育10min后,每例标本分别加入50μl p53及c-myc一抗工作液,4℃湿盒过夜,滴加生物素化二抗工作液,滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液,其间分别用PBS冲洗3min*3次/min。DAB显色,复染、脱水、透明,封片。以PBS代替一抗进行阴性对照。显微镜下观察,照相。根据阳性细胞表达率,采用SPSS17.0统计软件进行非参数Mann-Whiteny统计学分析,p<0.05,具有统计学意义。
实验结果
病理性瘢痕中P53蛋白主要分布于角质形成细胞和部分成纤维细胞的细胞核中;浅表性瘢痕其P53蛋白主要分布于少部分成纤维细胞的细胞核;而其在正常皮肤组织中主要分布于表皮基底层细胞的细胞核中。实验组的阳性率分别为A组91.67%;B组83.33%;C组66.67%。对照组D组41.67%;E组25%。实验组中,A、B两组比较,差异无统计学意义(p>0.05);B、C两组比较,差异具有统计学意义(p<0.05)。
病理性瘢痕中c-Myc蛋白主要分布于表皮基底层细胞、毛细血管内皮细胞和成纤维细胞的细胞核和细胞质中,着色浓且较均匀;浅表性瘢痕c-Myc蛋白主要分布于少部分成纤维细胞的细胞核和细胞质中:其在正常皮肤组织中主要分布于表皮基底层细胞、毛细血管内皮细胞的细胞核和细胞质中,但着色较淡验组的阳性率分别为A组83.33%;B组75.0%;C组58.33%。对照组D组41.67%;E组25%其中A组阳性率最高,B、C、D组阳性率依次降低。实验组中,A、B两组及B、C两组比较,差异无具有统计学意义(p>0.05)。
实验结论
1.p53基因在病理性瘢痕中呈现高表达,p53基因被激活,参与了病理性瘢痕的形成过程。
2.p53基因在瘢痕疙瘩及增生性瘢痕不同时期的蛋白表达量不同,所起到的作用不同。
3.c-myc基因在病理性瘢痕中呈现高表达,c-myc基因被激活,参与了病理性瘢痕的形成过程。
4.c-myc基因在瘢痕疙瘩及增生性瘢痕不同时期的蛋白表达量不同,所起到的作用不同。
5.P53蛋白与c-Myc蛋白在病理性瘢痕中的阳性表达趋势一致,可能与突变型p53基因与c-myc基因间存在协同作用有关。