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作为固着生长的植物,不可避免的会遭遇到各种环境胁迫的影响。环境胁迫通常分为生物胁迫和非生物胁迫,前者包括细菌、真菌等病原微生物和昆虫等节肢动物,后者则代指高盐、干旱等不利因素,这些环境胁迫对作物的生长和发育都会造成严重影响,是导致粮食减产和品质降低的主要因素。经过长期的进化,植物体产生了一套精细、复杂的调控网络来应对环境胁迫,包括丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)级联途径的激活,胁迫相关基因的表达,保护性蛋白的合成等等。筛选并研究植物体中全新的胁迫响应基因,深入解析植物响应胁迫的分子机理,对植物的“抗逆抗病分子育种工作”具有重要意义。非特异性脂转移蛋白(non-specific lipid transfer protein,ns LTPs)是植物中大量存在的一类富含半胱氨酸的小分子碱性脂质结合蛋白,先前研究表明ns LTP能跨膜转运多种脂类物质,并能够参与非生物和生物胁迫响应,但是具体的分子机理研究较少。我们在普通烟(Nicotiana tabacum,NC89)中克隆并获得功能未知基因NtLTP4,初步研究发现,过表达NtLTP4能增强烟草对干旱、高盐和青枯菌感染的耐受性。本研究对NtLTP4参与非生物和生物胁迫的分子机理进行了深入阐析。主要结果和结论如下:(1)NtLTP4响应多种胁迫诱导表达模式表明,NtLTP4受多种非生物胁迫(干旱、高盐和氧化胁迫)、生物胁迫(青枯菌)以及胁迫相关激素(脱落酸、茉莉酸、水杨酸和乙烯)等的显著诱导。诱导表达模式分析表明NtLTP4在植物生长发育及胁迫应答过程中发挥了重要且复杂的调控作用。(2)Nt LTP4是外分泌小蛋白用35S::NtLTP4-GFP转化烟草的亚细胞定位实验发现,转化烟草的荧光出现在细胞边缘,为确定该蛋白的具体定位,我们再次转化洋葱细胞并进行质壁分离实验,发现Nt LTP4主要定位于细胞壁和细胞外基质,说明NtLTP4是一种外分泌小蛋白,与其N端存在的分泌信号肽序列这一结果相互映证,表明Nt LTP4可能在细胞信号传导过程中发挥信号分子的作用。(3)NtLTP4作为正调控因子参与植物的非生物胁迫响应在高盐和干旱等胁迫条件下,与野生型对照组相比,NtLTP4的过表达株系表现出了极强的耐受性,种子萌发更快,幼苗根长更长,叶片失水更慢等。通过Na~+探针以及原子吸收法对Na~+含量进行检测发现,过表达NtLTP4明显降低了转基因烟草的Na~+含量,说明NtLTP4影响了植物体内Na~+的稳态。qRT-PCR检测发现,盐胁迫下,NtLTP4过表达株系中NHX1和HKT1两个关键Na~+转运体的表达量明显高于野生型,说明NtLTP4通过调控NHX1和HKT1促进Na~+向液泡的转运以及Na~+由地上向地下运输这两个过程,减弱了Na~+对植物细胞的毒害作用。另外,失水率和气孔开度的测定实验发现NtLTP4过表达烟草叶片气孔开度小,蒸腾速率低,说明NtLTP4能够通过降低气孔开度和叶片蒸腾速率来增强植物对干旱胁迫的耐受能力。(4)NtLTP4作为正调控因子参与植物抗病防御反应青枯菌病斑检测实验表明,过表达株系叶片萎蔫程度较低,细菌含量较少,野生型叶片萎蔫程度较高且细菌含量较多,说明过表达NtLTP4能够增强对青枯菌的抗性。qRT-PCR检测发现,过表达烟草体内的病程相关蛋白(pathogenesis-related protein,PR)的转录水平明显高于野生型;DAB,NBT染色分析以及ROS含量测定发现,病原菌侵染后转基因烟草具有较低的ROS积累,ROS清除酶的活性和含量远高于野生型;进一步气孔开度观察发现,过表达NtLTP4能够促进烟草气孔闭合,减少水分散失,减缓青枯菌侵染引发的叶片萎蔫。综上结果表明,NtLTP4通过诱导PR的表达,增强活性氧的清除,降低气孔开度,从而增强烟草对青枯菌的抗性。(5)Nt LTP4位于WIPK信号下游,并且两者存在直接互作为了进一步分析NtLTP4参与抗病的分子机理,我们通过酵母双杂交技术筛选烟草cDNA文库,筛选到7个重要的候选蛋白。有研究表明,MAPK级联信号通路在植物响应非生物和生物胁迫中发挥着重要的作用,故选择MAPK家族成员wound-induced protein kinase(WIPK)作为深入研究的对象。荧光素酶互补实验(firefly luciferase complementation imaging,LCI),双分子荧光互补实验(bimolecular fluorescence complementation,BIFC)和免疫共沉淀实验(co-Immunoprecipitation,co-IP)进一步确定了Nt LTP4与WIPK的互作关系。为了深入分析NtLTP4与WIPK之间的调控关系,我们在ntltp4突变体中利用TRV下调WIPK,获得ntltp4/wipk双突。接种青枯菌发现,ntltp4/wipk双突比ntltp4单突和wipk单突对青枯菌的敏感性加剧,叶片ROS积累增多,气孔开度更大,表明NtLTP4与WIPK都能参与植物抗病防御过程。进一步在NtLTP4过表达株系中利用TRV下调WIPK,获得NtLTP4/wipk材料;接种青枯菌发现,NtLTP4/wipk的表型与NtLTP4过表达株系的表型相似,叶片青枯菌含量较少,活性氧含量低,气孔开度减小,对青枯菌的抗性提高。上述结果表明,Nt LTP4位于WIPK的下游,与WIPK共同提高植物的抗病性。(6)WIPK可维持NtLTP4的蛋白稳定性通过Western Blot对NtLTP4的蛋白含量检测显示,在wipk突变体中NtLTP4的蛋白含量远低于对照,而在WIPK过表达株系中,NtLTP4的蛋白含量却高于对照,说明WIPK能够促进Nt LTP4蛋白的积累。cell-free半体内实验得到相同结果。而qRT-PCR检测发现,不同实验材料中NtLTP4的转录水平是基本一致的,表明WIPK促进NtLTP4的蛋白积累并非是调控NtLTP4的转录水平实现的。上述结果表明,WIPK能够在蛋白水平维持Nt LTP4的稳定性,从而提高植物的抗病性。(7)NPK1-NtMEK2-WIPK-Nt LTP4信号级联通路参与植物抗病防御过程为建立一条完整的烟草MAPK级联信号通路,我们利用酵母双杂交技术逐一验证了WIPK与烟草中已知的MAP2K/3K成员之间的互作关系,鉴定出WIPK能与MAPKK成员NtMEK2互作,进一步发现NtMEK2可以与烟草MAPKKK组分NPK1互作,并最终建立了NPK1-NtMEK2-WIPK-NtLTP4信号级联通路,这一级联通路可能是烟草中重要的抗病信号通路之一。综上所述,NtLTP4能够通过调控HKT1以及NHX1的转录增强烟草对Na~+的清除,减少植物因Na~+积累造成的毒害作用,从而提高盐胁迫的耐受性,并通过降低蒸腾速率和气孔开度增强对干旱胁迫的耐受性。另外,NtLTP4还能够通过增强活性氧的清除和降低气孔开度来提高转基因烟草对青枯菌的抗性。更深入地研究表明,Nt LTP4能够与MAPK级联组分WIPK互作。并且通过NPK1-NtMEK2-WIPK-NtLTP4级联信号通路稳定Nt LTP4蛋白来参与抗病防御过程,从而增强对非生物和生物胁迫的耐受性。本研究首次揭示了,烟草中MAPK级联通路与非特异性脂转移蛋白结合调控植物响应非生物和生物胁迫的分子机理,具有重要的创新意义。