低氧是许多生理和病理生理过程中都伴随的现象,如新生儿低氧、高原反应、心肌梗塞、脑创伤、脑缺血和卒中等。脑由于其耗氧量高,是低氧后最易受损的器官之一。缺血/低氧预适应(ischemic/hypoxic preconditioning,I/HPC)最初于1986年由美国学者 Murry 在心脏组织中发现,随后人们又在脑、肺、肝和肾等组织器官中观察到了类似现象。I/HPC是一种内源性保护机制,即亚致死性缺血/低氧预刺激可诱发组织器官对继发严重缺血/低氧所致损伤产生耐受。脑 HPC引起的保护机制可能为临床寻找防治缺血/低氧性脑损伤的策略提供新思路,因此对脑 HPC 发生发展的细胞分子机制进行研究具有重要意义。利用已建立小鼠整体 HPC 模型,我们曾发现,随着低氧暴露次数的增加,小鼠低氧耐受时间明显延长,并且丝裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPKs)家族中p38 MAPK 磷酸化水平在脑组织内明显增高,提示它可能参与了小鼠脑 HPC的发生发展过程。然而,p38 MAPK的激活在 HPC 降低大脑中动脉阻塞(middlecerebral artery occlusion,MCAO)所致小鼠脑局部缺血性损伤中作用仍不清楚。据此,本研究拟利用小鼠 HPC 和脑左侧 MCAO 所致局灶缺血模型,通过观察缺血后脑梗死体积、水肿率、神经行为学改变和神经细胞丢失等指标,探讨 HPC 对MCAO 诱发脑缺血性损伤的影响；应用蛋白印迹(Western blot)技术检测 HPC 对p38 MAPK 磷酸化水平及蛋白表达量的影响；在此基础上,应用 p38 MAPK 抑制剂(SB203580),探讨 p38 MAPK 在 HPC 保护缺血性脑组织中的作用。所获研究结果将丰富人们对脑 HPC 信号转导机制的认识。　　 实验在室温20-22℃下进行,选用成年雄性BALB/c小鼠(12-14w,18-22g),动物实验方法按照美国国立卫生研究院(NIH)制定的《实验动物饲养和使用》指南(NIH Publication No.80-23)进行。实验动物随机分为假手术组(sham)、缺血组(Ischemia)、预适应后假手术组(HPC+S)、预适应后缺血组(HPC+I)、HPC+DMSO+I组,以及HPC+SB203580+I等5组。小鼠在整体低氧暴露4次预处理(HPC)后1h,进行 MCAO 缺血模型的制备,术后6h通过观测小鼠的神经行为学评分、脑梗死体积、梗死区密度值、水肿率和缺血半影区神经细胞丢失程度等指标,来评价HPC降低小鼠脑缺血性损伤程度的保护作用；然后,收集缺血核心区(Ⅰ)、半影区(P)和缺血对侧皮质(C)组织,进行全细胞组分的提取,应用Western blot方法,观察HPC对小鼠脑缺血核心区、半影区及缺血对侧皮质组织内p38 MAPK磷酸化水平及蛋白表达量的影响；此外,侧脑室分别注射 p38 MAPK 抑制剂SB203580和DMSO(Dimethyl sulfoxide,对照),观察 p38 MAPK 在 HPC 脑保护过程中的作用。实验数据使用单一因素方差分析(One way ANOVA)和T-test检验进行统计学处理,并以均数±标准误(X±S.E.)表示,其中p<0.05 为差异显著。　　 实验结果如下:　　 1.随着低氧暴露次数的增加,小鼠对低氧的耐受时间逐渐延长　　 与低氧暴露1次(H1,16.90±1.20min)相比,重复低氧暴露2次(H2,27.21±0.44min)、3次(H3,32.65±0.58min)和4次(H4,34.00±0.80min)小鼠的低氧耐受时间明显增加(p<0.05,n=30),提示本实验成功地制备了小鼠HPC模型。选取低氧暴露4次小鼠进行以下研究。　　 2.HPC 明显缓解MCAO所致小鼠神经行为学改变　　 缺血后6h进行小鼠神经行为学评估。在单项神经行为学指标中发现,局灶性缺血损伤都可导致神经行为的明显改变,如运动减少、姿势侧倾、拖地步态、转圈、低反应性、前肢屈曲、前肢肌力下降和运动失调等,而HPC可明显缓解这些神经行为学改变；在神经行为学综合评价中,HPC 同样明显改善脑缺血小鼠神经行为学的综合评分(p<0.05,n=20)。　　 3.HPC 明显降低小鼠脑梗死体积、水肿率和梗死区密度值　　 2,3,5-氯化三苯四氮唑(TTC)染色结果显示,假手术组未见梗死灶,全脑呈均匀红色；缺血组大脑皮质及纹状体可见明显梗死区,呈苍白色,其余部分为红色。与单纯缺血组相比,HPC缺血组小鼠脑水肿率(p<0.05,n=12),脑梗死体积p<0.05,n=12)及梗死区密度值(p<0.05,n=12)均明显下降。　　 4.HPC 明显减少缺血半影区神经细胞的丢失　　 通过 NeuN(Neuronal Nuclei protein)和TUNEL(Terminal DeoxynucleotidylTransferase mediated-dUTP nick end labeling)染色研究缺血半影区神经细胞丢失状况。结果显示,在缺血6h后小鼠皮层缺血半影区内NeuN阳性细胞数目明显减少、TUNEL 阳性细胞数明显增多,而HPC可显著减少MCAO所致半影区神经细胞的丢失(p<0.05,n=6)。　　 5.HPC 对缺血组织内p38 MAPK 磷酸化水平和蛋白表达量的影响　　 在HPC对缺血小鼠脑内p38 MAPK磷酸化水平影响的研究中发现,在缺血后6h,p38 MAPK 磷酸化水平在半影区明显增高,而HPC可明显进一步加强MCAO所致半影区内 p38 MAPK 磷酸化水平的增高(p<0.05,n=6)。本结果表明,HPC可能通过增高 p38 MAPK 磷酸化水平减轻脑缺血损伤。　　 本研究还显示,缺血损伤明显降低缺血核心区 p38 MAPK的蛋白表达水平(p<0.05,n=6),但 HPC 不能完全缓解这种MCAO所致 p38 MAPK 蛋白表达量的降低(p>0.05,n=6)。结果提示,p38 MAPK 可能不以蛋白表达量的改变来参与HPC对继发缺血的脑保护作用。　　 6.p38 MAPK 抑制剂对 HPC 脑保护作用的影响　　 侧脑室注射 p38 MAPK 抑制剂SB203580(5nmol)可明显抑制缺血核心区、半影区和对侧皮层组织内 p38 MAPK 通路的激活。而注射 SB203580 溶剂DMSO(0.1％)并没有明显影响脑缺血梗死体积,梗死区密度值和水肿率。与HPC+DMSO+I 组相比,注射 SB203580 可明显增加脑缺血梗死体积(p<0.05,n=6)、梗死区密度值(p<0.05,n=6)和水肿率(p<0.05,n=6),并使半影区内凋亡细胞显著增多。结果提示抑制 p38 MAPK的激活明显减弱了 HPC 对缺血脑组织的保护作用。　　 综上所述,HPC 明显减轻MCAO所致脑缺血性损伤,即减小缺血梗死面积,降低脑水肿率和梗死区密度值,以及缓解缺血半影区神经细胞的丢失和缺血所致神经行为学的改变；在此基础上,HPC 可加强小鼠缺血皮层半影区内 p38MAPK 磷酸化水平的增高；同时,应用 p38 MAPK 特异性抑制剂可减弱 HPC的神经保护作用。本研究所获成果不仅丰富了人们对脑 HPC 信号转导机制的认识,而且为我们后续分离、鉴定与 HPC 神经保护作用相关的已知或未知信号蛋白奠定了基础。并且,也为临床上开发抗缺血/低氧性脑损伤药物提供了一定的实验依据。