抑郁症(Depression)是一种危害人类身心健康常见、慢性易复发的情感性精神障碍(Affective disorder)。抑郁症发作的典型症状包括:长久的持续的情绪低落、精神萎靡、快感缺失、认知功能障碍、睡眠紊乱、回避社交场合和社交活动等,且常并发其它神经性疾病和慢性生理疾病,比如焦虑、帕金森氏症、多发性硬化症、银屑病、系统性红斑狼疮、心血管疾病等。抑郁症产生原因比较复杂,社会学因素、生物学因素、心理学因素等都将不同程度的影响抑郁症的发作、进程、治疗及预后。其发病的危险因素主要有性别、年龄、种族、婚姻、社会经济状况和文化程度、遗传、生活事件和应激等。抑郁症病因尚不明确,因此抑郁症的发病机制也存在着多种病理生理假说。但是目前主要围绕单胺类递质分泌减少及其突触传递效能减弱,下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴的功能失调,应激环境与遗传因素相互作用,抑制和兴奋性突触传递和突触可塑性异常,以及大脑皮层和边缘系统的结构功能环路异常等理论探讨抑郁症的病因机制。针对复杂的致病机制,目前抑郁症的治疗方法主要包括:(1)抗抑郁药物(Antidepressant drugs):三环类抗抑郁药(TCAs),单胺氧化酶抑制剂(MAOI),选择性5-羟色胺重摄取抑制剂(Selective serotonin reuptake inhibitor,SSRI),选择性5-羟色胺及去甲肾上腺素重摄取抑制剂(Selective serotonin and norepinephrine reuptake inhibitors,SNRI)。(2)心理治疗(Psychotherapy):目前采取心理治疗常见的方式是认知行为疗法。(3)电痉挛疗法:患者全身麻醉的情况下,通过两个电极(通常位于患者的两颞)短期使电流脉冲穿过抑郁患者大脑,为此引发一次全身性的痉挛。(4)快速抗抑郁药物。目前关于应激环境与遗传因素相互作用导致大脑皮层和边缘系统的结构功能异常诱发抑郁症发作的理论得到广泛认可。神经解剖学研究表明抑郁症患者与调节情绪,奖励和执行功能相关的脑区及环路发生功能结构异常。这些高度互连的“边缘”区域不正常化被认为与抑郁症和抗抑郁作用有关。大量尸检和神经影像学的研究发现,抑郁症患者存在灰质体积减少和前额叶皮层及海马的神经胶质密度的降低,而这些脑区被认为介导抑郁症的认知方面,如无价值感和内疚情绪。前额叶皮层与认知处理、学习记忆及情绪处理相关的脑区存在着广泛的投射与连接,众多的研究者开始注意到前额叶皮层在情感认知及处理的过程中发挥着重要的作用。Micro RNAs(mi RNAs)是一类新近发现的约有22个核苷酸构成的内源性非编码小RNA,常在转录后水平调控基因的表达。作为表观遗传学调控的重要部分,最近研究表明,大量mi RNAs在中枢神经系统的不同脑区特异性的表达或富集,而抑郁症患者相关脑区的高级神经功能出现紊乱,并且这种功能的失调随后导致脑区中mi RNAs表达量发生变化。mi RNAs可通过调控神经发生、神经发育、突触可塑性及神经影响因子等生理过程参与抑郁症的病理生理学过程。本课题探究特定脑区前额叶皮层mi RNAs表达谱及转录组水平在抑郁症病理生理学中发生的变化,构建微妙、复杂和相互关联的基因表达调控网络数据库,通过建立慢性不可预知(Chronic unpredicted mild stress,CUMS)抑郁行为模型,运用二代测序、生物信息学分析、q RT-PCR、蛋白质免疫印迹、双荧光素酶报告和抑郁行为学检测等方法,从分子-突触-细胞-组织多维度进行研究。为揭示前额叶皮层在应激诱导抑郁症发病中的分子及表观遗传机制,我们首先利用高通量测序技术检测了慢性应激抑郁样行为小鼠前额叶中转录组和mi RNAs表达谱的变化。通过生物信息学分析及后续实验验证得到以下结果:1)经过慢性不可预知温和刺激(Chronic unpredicted wild stress,CUMS)处理小鼠三周后,行为学结果显示与对照组相比,抑郁样行为组小鼠糖水偏好值,M臂中停留时间与总臂中停留时间的比率显著降低(P<0.05),而强迫游泳中不动时间明显增加(P<0.01)。2)小鼠前额叶m RNA高通量测序结果表明:CUMS诱导的抑郁样行为中40 m RNA显著下调(Slc6a11、Hap1、Gad1、Gad2、Gng4、Slc32a1、Doc2g、Slc32a1、Magel2、Prkcd、Ngfr、Dusp1、Th、Itih3、Cacna2d2、Arc、Mbp、Peg10、Fos等),10个m RNA显著上调(Hba-a2、Beta-s、Hba-a1、Hbb-b1、Nr1d1、Flot2等);3)差异表达基因信号通路富集分析显示GABA能通路,多巴胺能,突触小泡循环,安非他明/吗啡成瘾,神经营养因子信号,MAPK信号及趋化因子-细胞因子受体信号传导等参与了慢性应激诱导的抑郁病理生理学过程。4)小RNA高通量测序分析表明,18个mi RNA(mi R-148b-5p、mi R-879-5p、mi R-144-3p、mi R-540-5p、mi R-582-5p、mi R-15b-5p等)在抑郁样行为组表达量显著升高。4个显著降低的mi RNA是mi R-384-5p、mi R-1264-3p、mi R-217-5p、mi R-490-5p。此外检测到7个新型mi RNA(novel-mir-46、novel-mir-214、novel-mir-213、novel-mir-10、novel-mir-39、novel-mir-128、novel-mir-54)。其中novel-mir-46的表达量在抑郁样行为组中明显高于对照组,novel-mir-214和novel-mir-213仅在抑郁样行为组中表达,而novel-mir-10、novel-mir-39、novel-mir-128及novel-mir-54仅在对照组中表达。5)通过三个靶基因预测数据库(Targetscan、RNA22和mi RDB)对差异表达的mi RNA进行靶基因预测,选择同被2个以上(包括两个数据库)数据库预测的靶基因,进一步与已经构建的差异基因进行重叠,绘制了抑郁样行为小鼠前额叶mi RNA/m RNA调控网络图。6)为了进一步验证RNA测序数据的准确性,我们选择了5个m RNA,其中包括两个显著升高的m RNA(Hbb-b1和Nr1d1),3个显著下降的m RNA(Gad1、Mbp和Slc6a11)及4个上升的mi RNA(mi R-879-5p、mi R-582-5p、mi R-144-3p、mi R-15b-5p)在对照(n=8)和抑郁样行为小鼠(n=8)前额叶进行q RT-PCR定量分析。这些差异表达的基因或mi RNA的q RT-PCR定量结果与RNA测序分析得到一致结果(P值均小于0.05),进一步证实了测序数据。前期本课题组徐爱萍等研究发现GABA能神经元释放递质能力降低,轴突支配输出能力受到损害。这表明CUMS诱导的抑郁症前额叶皮层的GABA能神经元功能发生病理性变化。并且第一部分高通量测序也表明差异表达的基因或mi RNAs富集到GABA能神经元通路。为进一步揭示GABA能神经元在CUMS诱导抑郁样行为中特异性损伤的分子及表观遗传机制,我们从GABA的合成,释放和重摄取的三个过程解析。利用q RT-PCR,蛋白免疫印迹,双荧光素酶报告等实验方法探究GABA能神经元功能损害的分子及表观遗传机制。实验结果如下:1)我们通过定量GABA合成(GAD67)、转运(VGAT)和重摄取(GAT-3)蛋白发现,与对照组(n=8)相比,抑郁样行为组小鼠(n=8)前额叶组织中GAD-67,VGAT和GAT-3蛋白表水平显著降低(P值均<0.05)2)高通量测序定量GABA合成(GAD67)、转运(VGAT)和重摄取(GAT-3)m RNA的表达水平,CUMS诱导的抑郁样小鼠(n=2)前额叶皮层中GAD1,VGAT和GAT-3显著低于对照小鼠(n=2)。采用q RT-PCR扩大样本进一步验证这些mi RNAs表达量。相比于对照组(n=8)来自CUMS诱导的抑郁症小鼠(n=8)的前额皮质中的GAD-67,VGAT和GAT-3的基因表达水平显著降低(P值均小于0.05)。3)生物信息学分析表明GAD67 3’UTR两个区域(769-775、902-908),VGAT 3’UTR的一个区域(622-628)和GAT-3 3’UTR的两个区域(272-278、1393-1399)与mi RNA-144-3p结合。mi RNA-15b-5p预测结合GAT-3 3’UTR的1740-1747区域。VGAT 3’UTR的一个区域(608-614)是mi RNA-582-5p的结合部位。mi RNA-879-5p预测结合GAT-3 3’UTR的486-492。4)q RT-PCR结果表明与GABA合成、转运和重摄取相关的mi R-15b-5p、mi RNA-879-5p、mi RNA-144-3p和mi RNA-582-5p在抑郁前额叶皮层组织中表达量显著增加。5)q RT-PCR定量结果表明GABA合成、转运和重吸收相关的m RNA和mi RNA之间存在负性相关。6)体外双荧光素酶报告显示mi R-15b-5p和mi RNA-879-5p直接负调控GTA-3,VGAT被mi RNA-144-3p和mi RNA-582-5p负调控,GAD1被mi RNA-144-3p直接负调控。本课题研究表明GABA合成、转运和重摄取的功能障碍与慢性应激诱导的抑郁症相关。应激诱导的GABA能神经元的亚细胞区室之间的不相容以及GABA能神经元和谷氨酸能神经元之间的不协调导致在内侧前额皮质中的不平衡的神经网络,其可能是抑郁症发作的病理基础。同时支持了慢性应激,表观遗传,基因/蛋白质表达,神经元萎缩导致抑郁症发病假说。未来的研究,我们需要将关于GABA能神经元紊乱的mi RNA/m RNA调控网络在机体层面作因果关系的研究。需要解决以下问题:mi RNA表达量的变化能否调控机体的抑郁样行为学表型;改变mi RNA的表达量能否通过改变靶基因表达或者活性,起到减缓抑郁状态的药效。