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目的子宫腺肌症(Adenomyosis,AM)是临床较为常见的妇科疾病之一,高发于育龄期妇女,另外经产妇(30-50岁)患病率最高,现有报道未生育年轻女性也有不低的患病率,发病明显年轻化。常见临床症状有:月经失调(40%—50%),以月经经期不规则延长、经血量明显增多为主;痛经(25%),且多呈继发性、进行性加重表现。子宫腺肌症的临床治疗需要充分依据和评估患者的症状体征轻重、有无生育要求等。目前没有根治的手段,现有治疗主要分为期待治疗,药物治疗和手术治疗。至于子宫腺肌症的病因,现在仍然不明。本论文主要探讨抑癌基因GRIM-19在子宫腺肌症发生发展中的表达情况及分子层面机制。本研究首先检测子宫腺肌症患者组织标本中GRIM-19的表达水平以及自噬和糖酵解水平的异常,寻找到与其相关的AMPK-ULK1通路,检测该通路在子宫腺肌症患者组织标本中的表达变化,同时通过细胞实验和GRIM-19+/-小鼠动物实验研究验证了 GRIM-19在子宫腺肌症发病中的调控作用,为子宫腺肌症可能的发病机制提供了有力证据。本研究以子宫腺肌症病变组织的类恶性肿瘤生物行为以及在位内膜的异常代谢水平切入,引入细胞凋亡相关基因GRIM-19,探寻GRIM-19及自噬和糖酵解在子宫腺肌症在位子宫内膜组织代谢过程中的作用机制,以阐明可能存在的相关发病机制。方法本研究首先检测子宫腺肌症患者在位内膜和健康对照者子宫内膜组织中GRIM-19、AMPK、ULK1的蛋白和mRNA表达水平,检测其自噬水平和糖酵解水平,并在人原代子宫内膜细胞和ISHIKAWA细胞中研究GRIM-19通过AMPK-ULK1信号转导通路对自噬和糖酵解的调控作用,最后构建GRIM-19+/-等位基因敲除小鼠,在其子宫组织中进行进一步验证。主要包括以下内容:1)收集符合实验要求的实验组、对照组子宫内膜标本,用含双抗的生理盐水轻柔反复浸洗各临床标本至浸洗液清澈,制成待检样本(分别于4%多聚甲醛溶液中固定或-80℃冻存)保存。2)运用RT-PCR技术、免疫组织化学染色技术和Western blot技术多水平多层次检测各样本中GRIM-19、AMPK、ULK1的表达,检测自噬标记物Beclin1、LC3B以及糖酵解关键酶PKM2的表达,以评估自噬和糖酵解水平。3)收集健康对照组子宫内膜标本,分离培养人原代子宫内膜基质细胞,鉴定细胞并分选,通过转染技术,在原代细胞中上调、下调GRIM-19的表达后,用Western blot检测各样本中AMPK、ULK1及自噬标记物Beclin1、LC3B表达。4)体外培养ISHIKAWA细胞,通过转染技术,在ISHIKAWA细胞中上调、下调GRIM-19的表达,后检测AMPK、ULK1以及自噬相关蛋白表达,并观察细胞活性变化。5)将转染后ISHIKAWA细胞用电镜固定液固定,在电镜下观察细胞超微结构,观测自噬小体形成情况,评估自噬水平。6)构建GRIM-19+/-等位基因敲除小鼠,分离取材GRIM-19+/-等位基因敲除小鼠的子宫组织,同时检测AMPK,ULKI以及自噬相关蛋白Beclin1和LC3B的表达。结果1.对照组子宫内膜组织和子宫腺肌症患者在位内膜组织(实验组)中,GRIM-19的表达主要定位于子宫内膜腺上皮细胞胞质中;GRIM-19蛋白水平在对照组和实验组中并没有随子宫内膜周期性变化而发生明显改变(P>0.05);子宫腺肌症患者在位内膜中GRIM-19蛋白表达水平与对照组相比明显减少(P<0.01)。2.子宫腺肌症在位内膜组织中自噬标志物指标Beclin1、LC3B的mRNA表达水平和蛋白表达均高于对照组(P<0.01),提示子宫腺肌症在位内膜组织自噬水平提高;同时子宫腺肌症在位内膜组织中糖酵解关键酶PKM2的mRNA表达水平和蛋白表达均高于对照组(P<0.01),并且这些变化不随子宫内膜周期性变化而出现明显改变(P>0.05)。3.子宫腺肌症在位内膜组织中AMPK,ULK1主要定位表达于子宫内膜腺上皮细胞,其mRNA和蛋白表达水平较对照组明显升高(P<0.01),且在对照组和子宫腺肌症在位内膜组织中没有因为子宫内膜周期性变化而发生明显改变(P>0.05)。4.在ISHIKAWA细胞和人原代子宫内膜细胞中上调GRIM-19(转染GRIM-19质粒)后,AMPK、ULK1蛋白和mRNA表达水平均较空白对照组明显下降(P<0.01P,同时Beclin1、LC3B表达较空白对照组明显降低(P<0.01)。5.在ISHIKAWA细胞和人原代子宫内膜细胞中下调GRIM-19(转染GRIM-19-siRNA),检测到AMPK、ULK1表达水平较空白对照组明显增高,同时Beclin1、LC3B表达较空白对照组明显升高(P<0.01)。6.在ISHIKAWA细胞中上调、下调GRIM-19表达后,在电镜观察自噬小体形成,提示自噬水平改变。7.GRIM-19+/-等位基因敲除小鼠子宫组织中AMPK,ULK1蛋白表达较野生型对照组升高(P<0.01),Beclin1、LC3B表达较野生型对照组升高(P<0.01)。结论1.GRIM-19在AM患者在位子宫内膜组织中表达降低。2.低水平表达的GRIM-19在AM中可能参与调控细胞自噬效应和糖酵解效应,从而影响AM在位内膜的正常代谢。3.GRIM-19在子宫内膜组织中可能通过AMPK-ULK1信号转导通路调控自噬效应。