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免疫细胞因子（immunocytokine）是一种抗体与细胞因子构成的融合蛋白，它将抗体独特的靶向作用与细胞因子的多功能生物活性有机结合，具有抗体和细胞因子的双重功能，可在肿瘤部位富集高浓度的细胞因子，诱导产生显著抗肿瘤效应，且有效避免细胞因子的毒副作用。 为构建抗肿瘤免疫细胞因子IP10-scFv，首先从RAW 264.7细胞中扩增小鼠趋化因子CXCL10（interferon-γ inducible protein 10，IP-10）基因，并克隆入pGEM-T载体，DNA序列测定表明克隆的CXCL10基因没有碱基突变。 利用重组噬菌体抗体系统（Recombinant Phage Antibody System, RPAS）构建抗酸性同功铁蛋白（acidic isoferritin, AIF）单链抗体（single-chain Fv antibody fragment, scFv）。从分泌抗AIF单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）杂交瘤细胞4c9中分别扩增小鼠抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因，用编码（Gly4Ser）3柔性接头的linker序列连接VH和VL基因（VH-linker-VL），并克隆入噬粒pCANTAB 5 E。以重组噬粒pCAN4c9转化大肠杆菌（E. coli）TG1细胞，与辅助噬菌体M13KO7体内重组，构建噬菌体scFv抗体库。用AIF抗原筛选阳性重组噬菌体，并对GP5克隆的scFv基因片段进行序列测定，提交GenBank／EMBL核苷酸数据库（登录号：AY134749）.AIF4c9 scFv基因含786个核苷酸（nucleotides, nt），编码261个氨基酸（amino acids, aa），其中VH 11 8aa、VL 109aa。AIF4c9 VH属于VH Ⅲ基因家族IA亚群，与该亚群中3F1H10 VH基因的同源性为93％；VL属Vκ19基因家族V亚群，与101.4.1 VL基因的同源性达98％，同源性分析提示AIF4c9 scFv的抗原结合位点主要由VH基因决定。 将AIF4c9 scFv基因亚克隆于原核表达载体pET28a的T7启动子下游，在E. coli BL21（DE3）中高效表达AIF4c9 scFv抗体。SDS-PAGE和Western blotting结果表明，AIF4c9 scFv表达蛋白在细胞质中主要以不溶性包涵体形式存在，不具有抗体活性。为获得功能性scFv抗体，以镍螯合亲和层析为基础建立柱内复性技术，scFv变性蛋白通过其两端的His-tag标签结合于镍螯合层析柱，并在线性降低的尿素浓度梯度复性溶液中逐渐复性，通过加入氧化型和还原型谷胱甘肽（GSSG／GSH）在3 mol／L尿素浓度引入氧化还原环境，显著提高功能性scFv抗体的回收率。优化的柱内复性程序可从高浓度的包涵体变性蛋白（最高15mg／ml）中高效复性AIF4c9 scFv表达蛋白，其回收率可达75％左右。AIF4c9 scFv复性蛋白具有良好的AIF抗体活性，可特异识别AIF抗原，其亲和力常数(KDscFv)为7.29×10-8mol／L，约比亲本mAb4c9(KDmAb=4.16×10-9mol／L)低20倍。表达菌体培养物的功能性AIF4c9 scFv抗体产量约为62mg/L。 将小鼠CXCL10和AIF4c9 scFv基因依次亚克隆于真核表达载体pcDNA3的巨细胞病毒启动子(PCMV)下游，并以编码（Gly4Ser）3柔性接头序列相连接，构建新型免疫细胞因子IP10-scFv，其核苷酸序列在Genbank／EMBL核苷酸数据库的登录号为AY25 1 299。用线性化表达质粒pc3IPIO4cg转染NSO细胞，经400林岁ml G418选择培养和ELISA抗体检测，建立稳定表达IP10一scFv融合蛋白的细胞株。以IP10一scFv表达细胞诱生小鼠腹水，用镍鳌合H始TraP层析柱分离纯化IPlo一scFv表达蛋白，其分子量约为50 kDa，大于理论估测值（41.1 kDa）。表达蛋白的糖基化和磷酸化等翻译后修饰直接影响IP 10一scFv融合蛋白表观分子量。 免疫细胞因子IPIO一scFv既保持了AIF4cg scFv的抗体特异性，又具备小鼠CXCLIO的趋化活性，具有抗体和趋化因子的双重功能。IPIO一scFv融合蛋白特异识别AIF，其抗体亲和力常数（KoIP，。一soFv）为2.2sxlo一8 molzL，高于AIF4egscFv，表明CXCLIO在VHN端的融合不影响scFv抗体对AIF的识别和结合。流式细胞仪分析显示，IP10一scFv与表达AIF的人肝癌细胞株SMMC 7721及表达CXCR3受体的活化小鼠T淋巴细胞特异结合。体外趋化试验表明，IP 10一scFv诱导小鼠T淋巴细胞产生明显趋化，其趋化效应与重组CXCL10相似，而AIF4cg ScFv未见明显趋化作用，提示IP10一scFv的趋化效应由其CXCL10结构域诱导产生。结合IP10一scFv的SMMC 7721细胞对小鼠T淋巴细胞也有良好趋化作用，且强于同等剂量的游离CXCLIO，表明结合于肿瘤细胞的IP10一scFv融合蛋白具有良好趋化活性，能在肿瘤细胞周围形成趋化因子浓度梯度，有效募集免疫效应细胞。IPIO一scFv与AIF的结合解离平衡反应促进趋化因子浓度梯度形成，肿瘤细胞分泌的AIF浓度也与趋化因子浓度梯度密切相关。 为研究免疫细胞因子IP10一scFv的体内抗肿瘤效应，我们选择与IP10一scFv特异结合的H22小鼠肝癌细胞株建立小鼠肿瘤模型。在H22小鼠肝癌肿瘤模型中，dl一d12或d6一dlZ肌肉注射2陀/d IPI压scFv融合蛋白显著抑制H22皮下肿瘤生长，IPIO一scFv试验组肿瘤组织中可见大量淋巴细胞浸润，肿瘤细胞明显减少，而对照组的肿瘤组织中未见明显淋巴细胞浸润，表明IP10一scFv融合蛋白特异识别体内H22肿瘤细胞，并在其周围募集免疫效应细胞，诱导产生有效的抗肿瘤免疫反应。护10一scFv/d6一dlZ试验组的抑瘤效应明显弱于dl一d12，提