敬钊缨毛蛛多肽毒素基因的真核表达及功能研究

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敬钊缨毛蛛(Chilobrachysjingzhao)是近年在我国发现的又一蜘蛛物种,分布于广西及海南等地。它的毒液是由许多生物活性成分组成的复杂混合物。我们在敬钊缨毛蛛粗毒中得到两个多肽毒素分子敬钊毒素34(JZTX—34)和敬钊毒素—Ⅲ(JZTX—Ⅲ)。JZTX—34由35个氨基酸残基构成,JZTX—Ⅲ由36个氨基酸残基构成,两者都含有三对半胱氨酸。为了对这两种毒素进行深入的研究,我们采用表达质粒pVT102U/α和酿酒酵母S78菌株构成的真核表达系统来表达这两个毒素。我们将敬钊缨毛蛛cDNA文库中编码两者成熟肽的核酸序列构建到pVT102U/α载体上进行分泌表达。 表达的JZTX—34能够抑制大鼠DRG细胞上TTX—S型钠电流,IC50值约为85nM,而对大鼠DRG细胞上TTX—R型钠电流没有影响。这种抑制可以在+120mV的强去极化刺激下消除。JZTX—34不影响该通道的激活动力学和失活动力学,也不影响其失活速率。但是,100nMJZTX—34能引起TTX—S钠通道的稳态失活曲线朝去极化方向漂移约10mV。这些结果表明JZTX—34可能是作用于哺乳动物感觉神经元钠通道,但其作用位点有待进一步研究。此外,由于JZTX—34前体肽序列末端含有酰胺化信号—RK,表达未能形成酰胺化修饰,这可能是表达的JZTX—34容易降解的原因。 表达的JZTX—Ⅲ与天然的毒素在分子、构型和生理学活性上都一致。我们构建、表达了JZTX—Ⅲ的25个突变体并表达成功,但是产量差异很大。另外,通过对HWTX—Ⅺ的表达条件进行优化,使表达产量大为提高。通过这些表达,我们发现影响蜘蛛多肽毒素基因表达的因素很多,为以后的表达研究提供了参考依据。
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