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目的1.通过检测HCMV即刻早期基因IE2在临床新鲜胶质瘤及急性脑外伤组织中的表达情况,明确HCMV感染与胶质瘤分级及发生发展的相关性;2.分析胶质瘤及急性脑外伤组织中ATF5启动子区Cp G岛甲基化情况及基因表达情况,探讨HCMV感染对ATF5启动子区Cp G岛甲基化水平及基因表达水平的影响;3.建立HCMV感染astrocytes、胶质瘤细胞系U87及原代胶质瘤细胞的细胞模型,在细胞水平探讨HCMV感染对ATF5启动子区Cp G岛的甲基化水平及基因表达水平的影响;4.研究S-腺苷甲硫氨酸对HCMV感染的胶质瘤细胞中ATF5启动子区Cp G岛甲基化水平及基因转录水平的影响,以及对甲基化相关基因(TET1、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)的表达水平的影响,探讨HCMV参与胶质瘤发展的可能机制,并为胶质瘤的治疗提供新的思路及靶点。方法1.收集新鲜的临床胶质瘤组织,并对临床病理资料进行汇总分析;2.采用RT-PCR法检测胶质瘤组织及对照组织中IE2 m RNA的表达水平,分析HCMV感染与胶质瘤分级及发生发展的相关性;3.使用在线软件分析ATF5基因启动子区Cp G的分布情况,预测Cp G岛,设计合成甲基化引物,然后提取组织DNA,重亚硫酸盐处理,PCR扩增,切胶回收,单克隆测序,分析各级别胶质瘤组织及对照组织中ATF5启动子区Cp G岛甲基化情况及其与HCMV感染及胶质瘤病理分级的相关性;4.Quantitative RT-PCR检测上述样本中ATF5基因的表达情况,分析病毒感染对甲基化水平及基因表达水平的影响;5.进一步结合临床资料分析ATF5启动子区Cp G岛甲基化状态与临床病理学特征的关系;6.分离培养人胚肺成纤维细胞及原代胶质瘤细胞,制备HCMV毒种,建立HCMV感染astrocytes、胶质瘤细胞系U87及原代胶质瘤细胞的体外细胞模型,并用S-腺苷甲硫氨酸处理细胞;7.采用BSP测序技术分析ATF5启动子区Cp G岛甲基化的变化,分析HCMV感染及S-腺苷甲硫氨酸对胶质瘤细胞ATF5启动子区Cp G岛甲基化水平的影响;8.采用RT-PCR及Western Blot检测HCMV感染及S-腺苷甲硫氨酸处理对ATF5及甲基化相关基因(TET1、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)表达的影响;9.CCK-8法检测HCMV及S-腺苷甲硫氨酸对细胞增殖的影响。结果1.共收集35例胶质瘤手术标本以及5例急性脑外伤组织标本作为对照。WHOⅠ-Ⅱ级为低级别,高分化,10例;WHOⅢ-Ⅳ级为高级别,低分化,25例。RT-PCR结果显示,胶质瘤标本中IE2 m RNA的表达量明显高于对照组织(P<0.05),并且高级别胶质瘤组织中IE2 m RNA的表达量也高于低级别胶质瘤组织(P<0.05),而对照组织中IE2呈现低表达,这表明IE2的表达量与胶质瘤分级密切相关;2.BSP测序结果显示,5例正常脑组织,10例低级别胶质瘤及25例高级别胶质瘤中ATF5基因启动子区Cp G岛的甲基化比例分别为87.78%、73.89%、47.70%,甲基化比例逐渐降低,且两两相比差异有统计学意义(P<0.05);3.Quantitative RT-PCR结果表明,与对照组相比,胶质瘤标本中ATF5表达水平升高(P<0.05);且HCMV阳性胶质瘤组织中ATF5表达水平高于HCMV阴性胶质瘤组织及对照组;ATF5表达水平与胶质瘤分级及HCMV感染具有相关性,且胶质瘤组织中ATF5基因启动子区Cp G岛的甲基化状态对该基因的表达有重要意义;4.在与患者的临床病理学特征的相关性分析中发现,ATF5启动子区Cp G岛的甲基化状态与胶质瘤分级密切相关(P<0.05);而与肿瘤大小、患者年龄等分析中,差异无统计学意义;5.HCMV感染后,显微镜下观察细胞形态,astrocytes、胶质瘤细胞系U87及原代胶质瘤细胞均出现典型的细胞病变效应,为HCMV容许细胞;6.BSP测序结果表明,在astrocytes中,病毒感染前,ATF5启动子区Cp G岛甲基化比例为96.30%,感染6h后,甲基化比例为46.30%,与对照组相比,甲基化比例明显降低(P<0.05);在U87及原代胶质瘤细胞中,病毒感染72h后,ATF5启动子区Cp G岛甲基化比例明显降低(P<0.05);SAM处理组以及HCMV+SAM共同处理组中ATF5启动子区Cp G岛甲基化水平升高;7.RT-PCR及Western Blot结果显示,HCMV感染能够提高胶质瘤细胞中ATF5m RNA及蛋白表达水平,SAM处理后,ATF5基因及蛋白表达水平下降;并且HCMV感染astrocytes6h及胶质瘤细胞72h后,TET1表达水平上升,DNMT1表达水平下降,而DNMT3A、DNMT3B没有明显变化。SAM处理组及HCMV+SAM共同处理组,TET1表达水平降低,DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的表达水平没有明显变化;8.CCK-8结果显示,HCMV感染能够促进胶质瘤细胞增殖,而SAM可以抑制胶质瘤细胞增殖,对astrocytes的增殖没有明显影响。结论1.HCMV即刻早期基因IE2在胶质瘤中高表达,与胶质瘤分级呈正相关;2.各级别胶质瘤组织中ATF5的甲基化水平低于对照组,而表达水平高于对照组,表明该基因的甲基化状态与胶质瘤分级有相关性,且对该基因的表达有影响;3.HCMV可能通过上调TET1表达水平,降低DNMT1表达水平,降低ATF5启动子区Cp G岛的甲基化水平,促进其基因及蛋白表达水平;4.SAM可能通过降低TET1表达水平,使得ATF5甲基化水平升高而抑制基因转录及表达,从而促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖。