本文的研究主旨是发掘极端有益微生物资源,并对糖苷水解酶相关基因进行克隆表达及酶学性质分析。本文的研究内容同包括两个大的部分：第一部分为四川大英盐湖可培养嗜盐菌多样性及多相分类研究,这部分主要筛选新的耐盐菌株以便开发新型抗逆耐盐基因资源,从而为分子育种提供新型高效的微生物资源和基因资源；第二部分为新型嗜热糖苷水解酶相关基因的克隆表达及酶学性质研究。这部分主要是通过获得新型编码糖苷水解酶基因并对其酶学性质及协同作用进行研究进而为纤维素生产应用提供高效纤维素酶资源。作为一种新型的、极具应用前景的极端微生物资源,嗜盐菌由于其独特的生理结构、遗传特性及代谢机制近年来受到人们的广泛关注。发掘新的嗜盐微生物资源从而深入揭示嗜盐微生物的耐盐、嗜盐机制并发现新的耐盐相关基因对作物的改造及盐碱地的改良利用等方面具有重要意义。分离筛选更多的未知嗜盐菌并进行鉴定是嗜盐微生物资源开发的必要前提和关键之一。嗜盐微生物广泛分布于盐湖、盐碱湖、晒盐场、盐岩和海洋等富盐环境,种类繁多,其耐盐性状与其适应环境的丰富酶系和活性产物相关。我国地域辽阔存在大面积的盐碱地与众多盐湖为嗜盐微生物的分离和系统分类工作的展开提供了条件。我们对从四川大英地区盐湖所采集的样品进行了嗜盐微生物的初步分离与鉴定,分离得到耐盐菌株与极端嗜盐菌株。通过实验发现大英盐湖的耐盐菌多于极端嗜盐菌并选取限制性内切酶Hinfl与Mbol对120株嗜盐、耐盐菌进ARDRA分析可知该盐卤水里存在12个类型的菌。从中选择47株菌通过16S rRNA全长序列系统发育分析和耐盐度的分析得出其主要归属于Bacillaceae (phylum Firmicutes), Halomonadaceae及Idiomarinaceae (class Gammaproteobacteria)。此外通过对极端嗜盐古菌株耐盐性、碳源利用分情况及16S rRNA全序列的测定初步推断可能有Halorubrum与Haloferax两个属的新种并对AS2-1做了形态特征、培养特征观察、生理生化测定、DNA (G+C) mol%测定以及16S rRNA全长序列系统发育分析等多项分类鉴定工作,后续鉴定工作正在进行中。另外一种极端微生物嗜热菌产生的糖苷水解酶由于其应用潜力已成为当今科学研究的热点。糖苷水解酶水解纤维素、半纤维素生成葡萄糖或者其他可发酵糖进而转化成生物燃料或其他产品。在现有的纤维素、半纤维素转化技术中,糖苷水解酶被认为是关键因素之一。而嗜热糖苷水解酶由于在高温条件下仍具有独特的热稳定性和高酶活性在纤维素生产应用中具有明显的优势。Caldicellulosiruptor bescii是来自于俄罗斯堪察加半岛的热泉的嗜热厌氧纤维素菌,可在83℃高温下生长。最适生长温度高达75℃,最适合pH值为7.1-7.3,被认为是一种最有潜能的生物能源细菌之一。本文基于Caldicellulosiruptor bescii全基因组序列的分析结果,筛选并预测出的两个编码糖苷水解酶的基因组簇Cb1953与Cbl954对其野生型及突变体进行克隆表达及酶学性质的的分析。结果表明,所克隆的Cb1953WT、Cb1953TM2、Cb1954TM3及Cb1954TM4为新型的嗜热纤维素内切水解酶基因,最适合酶温度分别为85℃、85℃、95℃及60℃,最适pH为另外所克隆的Cb1953TM1则为新型的嗜热甘露糖苷酶基因,最适合酶温度分别为90℃。基因的生物信息分析表明Cb1953TM1与Cb1953TM2属于编码糖苷水解酶第五家族(GH5)类型。该基因编码酶类为首次在Caldicellulosiruptor bescii中发现属于GH5的新型甘露糖苷水解酶和纤维素水解酶,故将它们分别命名为CbMan5A及CbCe15A。而克隆的Cb1954TM3属于糖苷水解酶第九家族(GH9)类型,并命名为CbCel9A。同时,我们还发现,虽然是同属于GH5家族的CbMan5A及CbCel5A,并同属于Cb1953基因簇,但是CbMan5A表达蛋白只表现出甘露糖水解活性,而CbCel5A表达蛋白则只表现纤维素水解酶活性。通过对两种酶表达蛋白的氨基酸比对及相关酶学性质分析,结果表明,两种新型水解酶在酶水解过程,酶动力学及热稳定性方面存在差异。本文同时对来自Caldicellulosiruptor bescii其他基因簇的内切纤维素酶与CbMan5A/Cel5ATM2的协同作用进行分析得出CbMan5A/Cel5ATM2仅能与产三糖的CbMan5B/Cel44ATM2具有增效作用其增效协同系数为1.2。