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目的:颅颌面骨缺损的有效重建是整形外科手术中面临的重大挑战。当前,自体骨移植或同种异体骨移植是临床上治疗骨缺损的“金标准”,但这两种方法仍然存在较大的局限性:自体骨移植的患者需要承受多次手术带来的痛苦,其中20%-30%的患者供区会出现瘢痕、损伤、畸形甚至残障等问题,且此方法不适用于大面积骨缺损的治疗;而同种异体骨移植患者的并发症发生率超过30%,包括骨折、骨不连、感染等。此外,颅颌面骨缺损的高发生率和治疗时所需花费的高额医疗费用对个人、家庭及社会带来了沉重的负担。因此,如何有效地治疗骨缺损关系到我国人民的生活水平以及社会、经济的发展。骨组织工程主要由种子细胞、诱导因子及支架材料三要素构成,其有效、合理的选择便成为推动骨组织工程临床应用的基础,为骨缺损的治疗提供了新的思路和方向。脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)是从脂肪组织中提取的一类具有多向分化潜能(成脂、成骨和成软骨分化等)和自我更新能力的成体多能细胞。因其具有体内存储量大、获取方便(通过吸脂手术等)、体外培养及扩增简便等优势,迅速成为一种热门“种子细胞”被广泛研究。实现干细胞的定向成骨分化是骨再生的关键,而“诱导因子”在此过程中发挥着至关重要的作用,寻找适当、高效促进成骨的“诱导因子”并探究其作用机制是本研究的重点。外泌体作为一种直径30-150nm的细胞外囊泡,其内包含DNA、RNA、蛋白质等物质,发挥着细胞间信息交流的作用,已经被广泛证实在组织再生方面发挥着重要作用,其中就有研究表明其能够促进骨再生修复。因此,脂肪干细胞衍生外泌体(ADSCs-derived exosomes)有望作为一种新型“诱导因子”应用于骨组织工程的构建中。然而,种子细胞和“诱导因子”均无法单独作用于局部的骨缺损,支架材料则提供了“基质”支撑的作用,传统镁及镁合金作为生物材料被广泛研究,然而仍存在降解速率过快等问题,限制了其临床应用。研究人员发现通过加入适当的元素,并调整元素占比可以对材料性能进行改善,本实验另一重点旨在探究新型Mg-2Zn-0.5Zr-0.5Nd合金材料的力学性能、耐腐蚀性能以及生物相容性,拟为骨缺损修复的临床应用提供实验基础。研究方法:1.提取通过吸脂手术获得的脂肪组织中的ADSCs,验证其成骨、成脂、成软骨的多向分化能力,并通过流式细胞分析检测其表面标志物CD10、CD13、CD49d、CD34、CD31、CD45、CD44、CD105、CD73表达情况。2.超速差速离心法提取脂肪干细胞衍生外泌体(ADSCs-derived exosomes),透射电镜(TEM)观察外泌体的囊膜结构,Western blot鉴定外泌体特异性标志物;用Dil染外泌体,Hoechst33258染细胞核,将Dil标记的外泌体和Hoechst33258标记核的ADSCs共孵育,通过荧光显微镜观察ADSCs摄取外泌体能力。3.超速差速离心法分别提取未经诱导的脂肪干细胞外泌体(Exos＿D0)与经成骨诱导14天的脂肪干细胞外泌体(Exos＿D14)。将实验分为ABCD四组:A.普通培养液+ADSCs(Negative control,NC组),B.Exos＿D0+ADSCs,C.Exos＿D14+ADSCs,D.成骨诱导培养基+ADSCs(Positive control,PC组),通过qPCR和Western blot检测成骨相关(ALP、RUNX2等)基因、蛋白的表达水平,ALP活性实验检测碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性,茜素红染色(Alizarin Red S,ARS)检测钙化沉积,验证不同分化阶段脂肪干细胞外泌体对未分化脂肪干细胞成骨分化的影响。4.通过基因芯片(Microarray)技术检测Exos＿D0与Exos＿D14内含物微小RNAs(microRNAs,miRNAs)表达变化,并将所得数据进行相关的生物信息学分析。5.筛选得到差异表达倍数最高的miR-130a-3p进行后续实验验证,探讨其对ADSCs增殖和分化的影响,并利用生物信息学方法进行下游靶基因与相关通路预测,双荧光素酶基因报告实验验证miR-130a-3p与下游靶基因SIRT7的靶向结合作用。6.利用慢病毒转染脂肪干细胞,将实验分为ABCD四组:A.正常ADSCs+成骨诱导培养基(Control组),B.空白病毒ADSCs+成骨诱导培养基(Lenti-control组),C.miR-130a-3p过表达ADSCs+成骨诱导培养基(Overexpression组),D.miR-130a-3p敲减ADSCs+成骨诱导培养基(Knockdown组),茜素红染色检测钙化沉积情况,qPCR检测成骨相关(ALP、RUNX2、Osterix等)基因表达,验证miR-130a-3p对ADSCs成骨分化的影响;CCK-8法检测miR-130a-3p过表达和敲减对ADSCs增殖的影响。7.在原分组基础上,继续引入DKK1(Wnt信号通路抑制剂)组,即Control+DKK1组、Lenti-control+DKK1组、Overexpression+DKK1组和Knockdown+DKK1组,通过Western blot、qPCR、碱性磷酸酶活性检测进一步验证Wnt信号通路在miR-130a-3p调控ADSCs成骨分化过程中的作用。8.利用化学分析、扫描电镜、万能电子试验机等对Mg-2Zn-0.5Zr-0.5Nd合金材料的性能进行检测。9.通过CCK-8检测细胞增殖,鬼笔环肽观察细胞骨架形态;手术构建兔下颌骨缺损模型,植入Mg-2Zn-0.5Zr-0.5Nd合金材料,利用microCT进行分析;从而在体内外验证Mg-2Zn-0.5Zr-0.5Nd合金材料的生物性能。结果:1.所提取的ADSCs能够分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞;流式分析结果显示CD34、CD31、CD45几乎不表达,而CD10、CD13、CD49d、CD44、CD73、CD105表达阳性。2.透射电镜下显示外泌体为直径30-150 nm的球形囊膜结构;Western blot结果显示TSG101和CD9表达阳性,Calnexin在外泌体中不表达;内化实验证实脂肪干细胞衍生外泌体6h内即可被同源细胞即脂肪干细胞大量摄取。3.Exos＿D14组相较于阴性对照组(普通培养液+ADSCs),ALP、RUNX2 mRNA和蛋白表达水平均有显著增加,而Exos＿D0组没有明显改变;茜素红染色及ALP活性实验均显示Exo＿D14组有较好的成骨效果。4.基因芯片技术检测发现Exos＿D14相较于Exos＿D0组,201种miRNAs上调,33种miRNAs下调,且具有统计学意义(p<0.05,|FC|≥2);生物信息学结果显示轴突导向(Axon guide)、Wnt信号通路(Wnt signaling pathway)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)等是主要涉及的信号通路,主要影响的生物功能和过程包括酶结合(Enzyme binding)、细胞投射(Cell projection)、转录因子活性(Transcirption factor activity)、基因表达调控(Regulation of gene expression)以及细胞代谢(cell metabolism)等;5.通过Targetscan在线预测软件,预测发现SIRT7是miR-130a-3p可能的下游基因,并用双荧光素酶基因报告实验加以证实。6.相较于Control组和Lenti-control组,Overexpression组ALP、RUNX2等成骨相关基因和蛋白表达水平显著增加,而Knockdown组表达水平有所减少,但结果无统计学意义。CCK-8结果显示Knockdown组细胞增殖率最高,Overexpression组最低;通过进一步研究,发现Overexpression组β-catenin、Axin2等蛋白表达水平明显上调;而相较于未用DKK1处理组,经DKK1处理组各组成骨相关(ALP、RUNX2、Osterix)基因、蛋白表达水平均有减少,且Wnt信号通路相关蛋白表达也显著下调。7.Mg-2Zn-0.5Zr-0.5Nd合金材料具有更加优良的力学性能和耐腐蚀性,且生物相容性良好结论:1.脂肪干细胞衍生外泌体更高效被同源细胞即脂肪干细胞摄取;经成骨诱导的脂肪干细胞外泌体可以促进未分化脂肪干细胞成骨分化,而未诱导脂肪干细胞外泌体不能。2.外泌体中miRNAs改变在脂肪干细胞成骨分化进程中发挥着重要作用。3.miR-130a-3p过表达能够促进脂肪干细胞成骨分化但抑制其增殖,而miR-130a-3p敲减促进脂肪干细胞增殖,对成骨分化抑制作用不明显。更进一步地,研究发现miR-130a-3p是通过靶向作用于SIRT7,从而正向调控Wnt信号通路促进ADSCs成骨分化过程。4.Mg-2Zn-0.5Zr-0.5Nd合金材料具有更加优良的力学性能和耐腐蚀性,且生物相容性良好