论文部分内容阅读
目的:胃癌是我国及亚太地区最常见的恶性肿瘤之一。本研究旨在寻找新的胃癌诊断蛋白质分子,进一步阐明胃粘膜上皮癌变的分子机制。方法:1.采用激光捕获显微切割(LCM)技术,分别获取高纯度的正常胃粘膜(NGM)、非典型增生(AH)、低分化腺癌(GPDAC)及淋巴结转移癌(LMGAC)组织,采用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)结合二维液相色谱联用质谱(2D LC-MS/MS)技术,寻找胃粘膜上皮癌变过程中不同阶段的差异表达蛋白质分子。2.选择PRSS1、HSP90α/β、TGM2、SerpinA3和P180蛋白质进行进一步的验证与分析。首先采用Western-blot,检测5个蛋白质在NGM、AH、GPDAC及LMGAC中的表达情况;其次通过免疫组织化学染色,观察5个蛋白质在组织芯片(包含NGM、AH、GAC及LMGAC)中的表达情况,检测结果采用ROC曲线分析,揭示5个蛋白质表达对胃腺癌早期诊断的评估作用。3.构建pcDNA3.1-PRSS1真核表达载体,转染GES-1细胞,建立了PRSS1高表达的GES-1细胞系(GES-1/pcDNA3.1-PRSS1),同时构建pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-PRSS1干扰载体,转染MGC803细胞,建立PRSS1低表达的MGC803(MGC803/pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-PRSS1)细胞系;通过绘制细胞生长曲线、平皿克隆形成实验、软琼脂集落形成实验、流式细胞术、Hoechest33258染色、细胞划痕迁移实验、Transwell迁移与侵袭实验,观察PRSS1表达改变对GES-1和MGC803细胞增殖、周期、凋亡、迁移与侵袭的影响;最后采用Western-blot检测PRSS1表达改变对GES-1和mgc803细胞中wnt1/β-catenin信号通路的影响。结果:1.本研究总共鉴定出胃粘膜上皮癌变相关差异表达蛋白质243个,在胃癌中表达上调的蛋白质153个,下调者90个,有的蛋白质在ngm、ah、gpdac及lmgac中表达均上调,有的则均下调,有的呈阶段性改变。通过分层聚类分析,将243个差异表达蛋白质聚集成3大群与8个簇。go功能注释显示,第1大群蛋白质的功能主要与细胞生长、凋亡、翻译与代谢等有关;第2大群蛋白质主要与器官发育、细胞凋亡与生物刺激应答等有关;第3大群蛋白质主要与细胞增殖、凋亡、代谢、转运、分子定位与免疫应答等有关。通过kegg通路分析,三大群蛋白质中参与一些肿瘤相关的信号通路,如细胞周期与凋亡、mapk、p53及erbb信号通路等。2.联合检测prss1、hsp90α/β、tgm2、serpina3和p180蛋白质表达,判别ngm与ah的敏感性和特异性分别为88%和84%,判别ngm与gac的敏感性和特异性分别为86%和85%,判别ngm与lmgac的敏感性和特异性分别为89%和87%,判别ah与gac的敏感性和特异性分别为88%和84%,判别ah与lmgac的敏感性和特异性分别为87%和83%。结果表明,prss1、hsp90α/β、tgm2、serpina3和p180联合检测,可用于正常胃粘膜、非典型增生、胃腺癌和淋巴结转移癌的鉴别。3.ges-1/pcdna3.1-prss1较ges-1/pcdna3.1(对照细胞)和未转染的ges-1细胞生长速度加快、平皿克隆和软琼脂集落数均增加、细胞凋亡率降低、细胞迁移与侵袭能力增强;mgc803/pcdna6.2-gw/emgfp-mir-prss1较mgc803/pcdna6.2-gw/emgfp-mir(对照细胞)和未转染的mgc803细胞生长速度降低、平皿克隆和软琼脂集落数均减少、细胞凋亡率增加、细胞迁移与侵袭能力减弱;PRSS1高表达促使GSE-1细胞中Wnt1与β-catenin蛋白质表达增加,而β-catenin蛋白磷酸化水平降低,PRSS1低表达使MGC803细胞中Wnt1与β-catenin蛋白质表达降低,而β-catenin蛋白磷酸化水平升高;PRSS1高表达促使GES-1细胞生长与增殖、迁移与侵袭能力增强,细胞增殖指数增高,细胞凋亡率下降,Wnt1/β-catenin信号通路活化;而PRSS1低表达则使MGC803细胞生长与增殖、迁移与侵袭能力降低,细胞增殖指数下降,细胞凋亡率减少,Wnt1/β-catenin信号通路抑制。结论:1.胃粘膜上皮癌变过程中发生了蛋白质表达谱的改变,本研究鉴定出相关蛋白质243个。2.联合检测PRSS1、HSP90α/β、TGM2、SerpinA3和P180蛋白质表达,可为胃癌早期诊断提供参考。3.PRSS1通过影响Wnt1/β-catenin信号通路,调节细胞的生长与增殖、迁移及侵袭。