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背景及目的:本课题组前期研究发现,在缺氧条件下,15-脂质氧化酶(15-1ipoxygenase,15-LOX)表达增高,其分解花生四烯酸(arachidonic acid,AA)的主要活性产物15-羟基二十碳四烯酸(15-Hydroxyeicosatetri-enoic acid,15-HETE)可引起大鼠颈内动脉环收缩,且此收缩作用可被电压依赖性钾通道(voltage-gated otassium channel,Kv)阻断剂所抑制,提示缺氧可引起15-LOX表达增加并通过其产物15-HETE作用于Kv通道,引起脑动脉收缩,但此过程中潜在的离子通道机制尚未完全清楚。本课题旨在前期基础上进一步研究:15-HETE对缺氧条件下大鼠脑动脉平滑肌细胞(cerebral artery smooth muscle cells,CASMCs)上钾离子通道及钙离子浓度的影响,分别就Kv通道亚型蛋白质及基因表达水平、全细胞钾电流(Ik)、细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)等方面进行检测,并进一步探讨.15-HETE引起钙动员的来源并引入15-LOX抑制剂以明确缺氧是否通过内源性15-HETE实现对Kv通道表达的调节作用。
方法:实验分五方面进行:①细胞培养:采用木瓜蛋白酶及II型胶原酶联合消化法分离大鼠CASMCs,并置于含5% C02/95% 02的二氧化碳孵箱内培养。)Kv亚型蛋白质及基因检测:将培养的CASMCs随机分为对照组、缺氧组及5-HETE组。运用Western Blot和RT-PCR法检测15-HETE及缺氧对CASMCs中Kv1.5、Kv2.1亚型蛋白质及mRNA表达的影响;③膜片钳:急性分离大鼠CASMCs,采用膜片钳技术测定全细胞Ik,以观察15-HETE及缺氧对大鼠CASMCs Ik的影响。④激光共聚焦:急性分离CASMCs,采用激光扫描共聚焦显微镜观察15-HETE对大鼠CASMCs[Ca2+]i的影响,并在此基础上,引入L型钙通道阻断剂硝苯地平、钙通道蛋白瞬间受体电位通道C阻断剂La3+、无钙液及胞内钙库耗竭剂咖啡因,以进一步确定钙动员的来源。⑤内源性15-HETE抑制实验:引入15-LOX抑制剂NDGA抑制内源性15-HETE的表达,观察缺氧对Kv2.1亚型表达的抑制作用有无改变。将大鼠CASMCs分为5组,即对照组、缺氧组、缺氧+NDGA组、缺氧+NDGA+15-HETE组、缺氧+15HETE组,运用Western blot和RT-PCR技术检测各组Kv2.1亚型mRNA及蛋白质表达的变化情况。
结果:①缺氧和15-HETE均可使Kv1.5和Kv2.1通道蛋白质及mRNA的表达降低(P<0.05),二者抑制程度无明显差异(P>0.05)。②15-HETE可使Ik幅度减低(P<0.05),且与缺氧的抑制作用无明显差异(P>0.05);③15-HETE可使[Ca2+]i增高(P<0.05),预先加入硝苯地平、La3+或改用无钙液阻断外钙内流后,15-HETE仍可使[Ca2+]i增高,而预先加入咖啡因耗竭内钙后,再加入15-HETE则不能引起[Ca2+]i进一步增高:④缺氧+NDGA组与单纯缺氧组相比,Kv2.1通道的蛋白质及mRNA的表达明显增加(P<0.05),提示NDGA通过阻断内源性15-HETE从而削弱了缺氧对Kv2.1的抑制作用。
结论:
1.缺氧通过15-HETE下调Kv1.5、Kv2.1通道蛋白质及mRNA的表达,同时从功能上抑制全细胞Ik,从而导致CASMCs上功能性Kv通道减少。
2.15-HETE可刺激Ca2+从细胞内钙库中释放出来,使细胞内[Ca2+]i增加,进而引起脑动脉收缩。
3.缺氧通过内源性15-HETE抑制Kv2.1蛋白质及mRNA的表达。
综上,缺氧可能通过15-LOX/15-HETE这一中间环节实现对Kv通道的抑制,进而引起[Ca2+]i增高,最终导致脑动脉平滑肌收缩。