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目的PI3KC3抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)、Bcl-2抑制剂ABT-737干预染尘NR8383细胞后,通过观察其自噬活动变化,探讨Beclin1/PI3KC3、Beclin1/Bcl-2复合物在矽尘诱导NR8383细胞自噬中的调控作用。方法常规培养NR8383细胞,经CCK-8法确定3-MA和ABT-737药物浓度;将细胞随机分为六组:对照组、矽尘组、3-MA组、3-MA干预组(3-MA+矽尘)、ABT-737组和ABT-737干预组(ABT-737+矽尘),提前1h对药物组行药物预处理,之后向各组中加入终浓度为50μg/ml的矽尘悬浮液,孵育1h、3h、6h、12h、20h后,收集细胞。瑞氏-吉姆萨复合染色法观察染尘NR8383细胞形态;免疫荧光法观察不同组别不同时间NR8383细胞LC3B绿色荧光表达;蛋白免疫印迹法检测LC3B、p62、Beclin1、PI3KC3、Bcl-2蛋白表达;免疫共沉淀检测Beclin1/PI3KC3、Beclin1/Bcl-2复合物的表达。结果1 CCK-8法确定3-MA和ABT-737浓度:3-MA处理后,细胞在低浓度(0.5、1、2、5m M)时细胞存活率与无药物组无统计学差异(P>0.05),而在10m M时细胞存活率明显下降(P<0.05),经预实验确定3-MA浓度为5m M;不同浓度ABT-737干预后,细胞在低浓度(0、0.5、1、2.5μM)时细胞存活率无统计学差异(P>0.05),而当浓度为5μM和10μM时细胞存活率下降(P<0.05),经预实验确定ABT-737浓度为2.5μM。2 NR8383细胞瑞氏-吉姆萨复合染色:对照组NR8383细胞形态完整,细胞核和细胞浆较清楚,矽尘组各时间点细胞胞核和胞浆染色均较深,且胞浆变稠密,胞质中含类似粉尘状颗粒物。3免疫荧光观察NR8383细胞自噬活动:矽尘组、3-MA干预组和ABT-737干预组随染尘时间延长,LC3B点状聚集,绿色荧光强度先增强后减弱,且各时间点的荧光强度均强于同一时间点的对照组;矽尘组各时间点LC3B绿色荧光强度强于同时间点的3-MA干预组,低于同时间点的ABT-737干预组。加入溶酶体抑制剂二磷酸氯喹(chloroquinediphosphate,CDP)后,自噬体降解受阻,各组LC3B绿色荧光强度均呈不同程度的增强。4 3-MA干预后自噬相关蛋白及复合物的表达:析因设计方差分析结果显示,LC3B、p62、Beclin1、PI3KC3蛋白表达在不同处理组间有统计学差异(P<0.05),矽尘组LC3B、Beclin1表达高于对照组和3-MA干预组,p62表达低于对照组和3-MA干预组,PI3KC3表达高于对照组和3-MA干预组;处理后各时间点各蛋白表达有统计学差异(P<0.05),处理后6h LC3B、Beclin1表达高于其他四个时间点,p62表达低于其他四个时间点;所有组合的交互效应均显著(P<0.05)。矽尘组和3-MA干预组NR8383细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值随染尘时间先增大后减小,且6h最高(P<0.05),矽尘组NR8383细胞LC3B表达在各时间点均高于对照组(P<0.05),除1h外其表达均高于3-MA干预组;Beclin1、PI3KC3与LC3B表达趋势一致;矽尘组和3-MA干预组p62随染尘时间先降低后升高,且6h时最低(P<0.05),矽尘组各时间点p62水平均低于3-MA干预组和对照组(P<0.05)。免疫共沉淀结果显示PI3KC3沉淀的蛋白样品中检测到Beclin1蛋白,且加入3-MA后Beclin1蛋白表达减少。5 ABT-737干预后自噬相关蛋白及复合物的表达:LC3B、p62、Beclin1、Bcl-2蛋白表达在不同处理组间有统计学差异(P<0.05),矽尘组LC3B、Beclin1表达低于ABT-737干预组,p62表达高于ABT-737干预组,Bcl-2表达低于对照组,高于ABT-737干预组;处理后各时间点各蛋白表达有统计学差异(P<0.05),且处理后6h LC3B、Beclin1表达高于其他四个时间点,p62表达低于其他四个时间点;所有组合的交互效应均显著(P<0.05)。矽尘组和ABT-737干预组NR8383细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值随染尘时间先增大后减小,且6h最高(P<0.05),矽尘组NR8383细胞LC3B表达在各时间点均低于ABT-737干预组;Beclin1与LC3B表达趋势一致;矽尘组和ABT-737干预组p62随染尘时间先降低后升高,且6h时最低(P<0.05),矽尘组各时间点p62水平均高于ABT-737干预组(P<0.05);Bcl-2蛋白表达趋势与p62一致。免疫共沉淀结果显示在Beclin1沉淀的蛋白样品中检测到Bcl-2蛋白,且加入ABT-737后Bcl-2表达减少。结论1游离二氧化硅粉尘可诱导大鼠肺泡巨噬细胞NR8383细胞发生自噬。2 3-MA可通过降低PI3KC3活性抑制Beclin1/PI3KC3复合物,降低染尘NR8383细胞自噬活性,提示Beclin1/PI3KC3复合物在染尘NR8383细胞自噬中起正性调控作用。3 ABT-737可通过抑制Bcl-2蛋白表达,降低Beclin1/Bcl-2复合物活性,激活Beclin1,增强染尘NR8383细胞自噬活性,提示Beclin1/Bcl-2复合物在染尘NR8383细胞自噬中起负性调控作用。