第一部分：晚期缺血预适应促进低氧诱导因子的表达减轻肾脏缺血再灌注损伤背景和目的：急性肾损伤(acute kidney inj ury, AKI)是一种常见的临床危重病症,缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤是导致AKI的重要因素。因此,寻找特异性干预手段来预防和治疗急性缺血性肾损伤是肾脏病学界亟待解决的重要问题。缺血预适应(ischemic preconditioning, IPC)是迄今为止发现的最强有力预防缺血性器官损伤的内源性措施。晚期IPC保护作用在预缺血12-24小时后出现,持续几天甚至数周。晚期IPC由于需要合成新的蛋白质、保护作用更持久稳定。缺氧是缺血性损伤发生中最早的环节,而低氧诱导因子(hypoxia inducible factor, HIF)在细胞氧自稳调节中起关键作用,HIF-1α和HIF-2α是HIF-α亚基的两个重要亚型。以往研究发现,HIF-1α高表达在心、脑等脏器的IPC起重要作用,而HIF-1α和HIF-2α在肾脏晚期IPC中的作用尚不清楚。我们根据以往大鼠晚期IPC的研究经验,将采用预缺血15min-缺血间隔时间4d-再次缺血30min,建立肾脏晚期IPC小鼠模型,观察晚期IPC对肾脏I/R损伤的保护作用以及HIF在其中的作用。材料和方法：雄性C57BL/6N小鼠,22-26g,随机分为3组。假手术组(Sham):只分离两侧肾蒂,不进行夹闭；缺血再灌注组(IR)：用无损伤动脉夹持续夹闭两侧肾蒂30 min,然后恢复灌注；缺血预处理组(IPC)：第0天夹闭两侧肾蒂15 min,造成预缺血,间隔4天后,再次缺血30 min,然后恢复灌注。再灌注后2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、1周和2周处死小鼠。每组每个时间点n=6。采用酶法测定血清肌酐(Scr)浓度、尿素酶-GLDH法测定尿素氮(BUN)浓度来评价肾功能；PAS染色观察肾组织的病理改变；采用比色法检测肾组织MPO水平；通过原位末端标记法(TUNEL)和细胞增殖抗原PCNA免疫组织化学检测细胞凋亡和增殖情况。采用Western blot和免疫组织化学法检测HIF-1α和HIF-2α在肾组织的表达和分布。通过荧光定量实时PCR检测VEGF和Glut-1的mRNA表达。结果：1)IR组小鼠存活率仅为57%,IPC组和Sham组小鼠存活率达100%。与Sham组相比,IR组血肌酐和尿素氮明显升高,再灌注后24 h达高峰,以后肾功能逐渐恢复；再灌注后2 h-2周,IPC组血肌酐均较IR组明显降低(P<0.05)。2)IPC组小管间质损伤形态学表现较IR组显著减轻,再灌注后2h、24h和1wIPC组小鼠小管间质损伤评分较IR组显著改善(P<0.05)。3)单纯IR组小鼠再灌注后各时间点肾组织MPO水平高于IPC组,以再灌注后2h、6h和24h尤为显著(P<0.05)。4)IR组小鼠再灌注后6h即出现凋亡的肾小管上皮细胞(TUNEL阳性细胞),再灌注后24 h肾小管上皮细胞凋亡达到高峰,凋亡细胞主要集中在皮髓交界和外髓质,肾小球内凋亡细胞较少。IPC组小鼠肾脏TUNEL阳性细胞数较IR组明显减少(12.3±1.5/HPF vs 38.2±2.0/HPF, P<0.01)。5)再灌注后24h至72h,单纯IR组在大量死亡的肾小管上皮细胞中,间插有少数细胞增殖(PCNA阳性细胞),与IR组相比,IPC组PCNA阳性细胞数明显增多,主要出现在近端肾小管(63±5.48/HPF vs 32.6±7.06/HPF,P<0.01)。6) Western blot结果所示,与Sham组相比,单纯IR组和IPC组肾脏HIF-1α表达从再灌注后2h就开始增加,24 h达高峰,IPC组HIF-1α高水平表达持续到再灌注后48 h,且再灌注后6h至1周肾脏HIF-1α的蛋白表达量均显著高于单纯IR组,差异有统计学意义(P<0.01)。HIF-α表达趋势与HIF-1α相似。再灌注后各时间点HIF-2a水平高于单纯IR组,再灌注后12h-1w肾脏HIF-2α差异表达有意义(P<0.01)。免疫组化可见在肾脏组织中HIF-1α主要在’肾小管上皮细胞表达,HIF-2α主要在肾间质细胞、血管内皮细胞和肾小球内表达,且IPC组小鼠肾组织HIF-1α和HIF-2α细胞表达均较IR组增强。7)IPC组小鼠肾脏VEGF的mRNA表达从再灌注后12h出现明显升高,48 h达到高峰,并以较高水平持续至再灌注后1周,再灌注后12h至1周肾组织VEGF的mRNA表达量均高于单纯IR组(P<0.05)。IPC组小鼠肾脏Glut-1的mRNA表达从再灌注后6h逐渐升高,72 h达到高峰,以后逐渐减少但仍维持于较高水平,再灌注后12h至2周肾组织Glut-1的mRNA表达量均高于单纯IR组(P<0.05)。结论：1)晚期缺血预处理能够改善肾功能,减轻肾组织病理损伤,减少再灌注后炎症反应；2)晚期IPC能够减少小管上皮细胞死忘,促进其增殖修复;3)晚期IPC可以通过诱导HIF-1α和HIF-2α高表达,增加小管上皮细胞的耐缺血/缺氧能力,HIF-1α和HIF-2α表达趋势在缺血再灌注后表达趋势相似,在肾组织的细胞分布不同；4)HIF对晚期IPC的肾脏保护作用可能是通过调控下游基因Glut-1和VEGF实现的。总之,采用预缺血15 min—间隔4 d—再次缺血30 min的方法,可成功肾脏晚期缺血预适应小鼠模型。晚期IPC通过促进HIF及靶基因的高表达,减轻缺血再灌注损伤。第二部分：miR-21在肾脏晚期缺血预适应中作用以及HIF对miR-21调控背景和目的：微小RNA (microRNAs, miRNAs)作为一类具有重要调控作用的内源性小RNA分子广泛参与机体多种生物学过程的调控,然而miRNAs在肾脏I/R损伤中作用尚不明确。在肿瘤研究中发现一系列的缺氧相关miRNAs (hypoxia-regulated microRNAs, HRMs),且HIF是缺氧情况下HRMs表达的关键调节因子。miR-21是已发现的HRMs之一,miR-21是一个具有抗细胞凋亡作用的重要miRNA,这种抗凋亡作用是通过抑制程序性细胞死亡因子4(Programmed Cell Death 4, PDCD4)等促凋亡靶点而实现的,但还未有报道miR-21与HIF明确的调控关系。本研究在成功建立肾脏晚期IPC小鼠模型的基础上,拟探讨miR-21在晚期IPC肾脏保护中的重要作用；并且通过体外细胞缺氧模型,明确HIF对miR-21表达的调控作用以及miR-21对缺氧情况下细胞增殖和凋亡的影响。材料和方法：雄性C57BL/6J小鼠(20-22g)给予15min双侧肾脏缺血,术后4h、24 h和4天处死小鼠,收集血样和肾脏标本。假手术组(Sham)只分离两侧肾蒂,不进行夹闭。IPC模型和I/R模型中,15min预缺血和假手术后4天,各组小鼠均给予双侧肾脏30min缺血后再灌注24h。锁核苷酸(locked nucleic acid, LNA)修饰的anti-miR-21或anti-scrambled干预组小鼠,在预缺血和30min缺血前30min-1h给予相应处理(每组每个时间点n=6)。采用改良的Jaffe方法测定Scr; PAS染色观察肾组织形态学；TUNEL检测细胞凋亡情况；通过real time PCR检测miRNAs以及靶基因mRNA表达；Western blot检测PDCD4蛋白和HIF核蛋白的表达。通过原代人肾脏上皮细胞,利用CoCl2化学缺氧和2%02低氧培养建立体外细胞缺氧模型。利用含有低氧反应元件的HIF decoy双链寡核苷酸,抑制缺氧情况下细胞HIF的活性。LNA anti-miR-21或anti-scrambled转染HRE细胞,抑制细胞miR-21的表达。通过MTT检测和Caspase-3/7检测缺氧情况下细胞的增殖和凋亡结果：1)与Sham+I/R组相比,15min预缺血明显增加再次I/R后肾脏miR-21的表达(179.18%±17.42% of Sham+I/R, P<0.05)。IPC+I/R组再灌注后24h肾组织miR-21靶基因PDCD4 mRNA表达较Sham+I/R组表达明显下降(87.23%±4.55% of Sham+I/R, P<0.05),然而miR-21靶基因PTEN mRNA的表达在两组间没有统计学差异。2)预缺血处理后4h肾组织miR-21的表达逐渐升高,直至预缺血后第4天；且预缺血后4h和第4天肾组织miR-21的表达均显著高于Sham组(P<0.05)。尽管其他损伤相关的miRNAs如miR-320、miR-214和let-7e的表达在预缺血后第4天均有升高,但差异并不显著。3) LNA anti-miR21明显降低再次I/R后24h肾组织miR-21的表达水平,为对照组的2.43%±0.71%(P<0.01)。抑制miR-21表达削弱了IPC的肾脏保护作用,表现为anti-miR-21组小鼠再灌注后24h血清肌酐的升高(0.21±0.01 vs.0.31±0.02mg/dL, scrambled对照vs. LNA anti-miR-21, P<0.01)以及肾脏I/R病理损伤的加重。没有预缺血的情况下。anti-miR-21同样明显减少再灌注24h后肾组织miR-21的表达水平,但却不影响肾脏I/R损伤。anti-miR-21明显上调PDCD4蛋白的表达水平(P<0.01)。同时,与对照组小鼠相比,anti-miR-21组再灌注后24h小鼠肾组织内表现明显增加凋亡的肾小管上皮细胞(3.15%±0.59% vs.15.65%±2.84%, scrambled对照vs. LNA anti-miR-21, P<0.01)。4)预缺血激活HIF-1α蛋白表达,预缺血组15min缺血后早期(4h)肾组织HIF-1α蛋白表达即升高,明显高于sham组(134.36%±8.81% of the Sham, P<0.05)。尽管预缺血晚期(4天),肾组织HIF-1α蛋白表达稍有所下降,但仍高于Sham组(120.41%±5.25% of the Sham, P<0.05).5)物理缺氧(2%O2低氧培养24h)和化学缺氧(CoCl2 300uM处理4h)可以明显上调miR-21的表达水平(182.69%±9.07% of CoCl2对照,P<0.01；167.74%±21.85%of常氧对照,P<0.05)。与scrambled对照组相比,HIF decoy抑制HIF活性的同时明显减少CoCl2处理后HRE细胞的miR-21表达水平,减少对照组的42%%±12.89%(P<0.05)。6)以150μM CoCl2处理细胞24h建立细胞缺氧模型,LNA anti-miR-21有效抑制缺氧情况。下HRE细胞的miR-21表达水平(11.41%±2.26% of scrambled对照,P<0.01)。MTT检测的结果所示,抑制miR-21明显减慢缺氧情况下HRE细胞生长(P<0.01),尽管抑制miR-21后Caspase3/7的表达稍上调,但没有统计学差异。结论：1)晚期IPC诱导miR-21高表达,减少miR-21促凋亡靶基因PDCD4表达；2)通过LNA anti-miR-21抑制IPC诱导的miR-21,加重缺血再灌注后肾功能减退和病理损伤,削弱预缺血的肾脏保护作用；在缺少预缺血的情况下,抑制肾脏I/R引起的miR-21表达却并不加重肾脏I/R损伤；3)抑制miR-21增加靶基因PDCD4表达以及肾小管上皮细胞凋亡：4)细胞在缺氧状态下可诱导miR-21高表达,低氧诱导因子HIF在缺氧情况下调节miR-21的上调起着重要作用：5)在缺氧情况下,缺氧诱导的HIF-1α可能通过miR-21来维持细胞生存。总之,在肾脏晚期IPC中,HIF除了直接促进VEGF和Glut-1保护性基因的表达,还能通过上调miR-21,减少靶基因PDCD4及肾小管上皮细胞凋亡,保护肾脏功能。