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目的:放射治疗技术的飞速发展使得放疗后脑肿瘤患者的生存期显著延长,但放疗带来的脑损伤因可能严重降低患者治疗后的生存质量而受到越来越多的关注,尤其是发生率较高的颅脑照射造成的认知功能损害。临床研究显示,在接受全脑放疗后生存期大于六个月的患者中,认知功能障碍的发生率可高达50%-90%。研究发现,电离辐射对神经发生（neurogenesis）的抑制在放射性认知障碍的发生中发挥着重要作用,因此被认为是放射性认知损害发生的重要机制之一。神经干/祖细胞（neural stem/progenitor cells,NSC/NPCs）存在于包含多种类型细胞的微环境中,易受微环境中其它细胞的影响。颅脑放射治疗时,肿瘤细胞为照射靶细胞,受照靶区外的NSC也可能会受肿瘤细胞的影响。故本研究主要探究受照肿瘤细胞是否通过电离辐射旁效应使未受照NSC产生生物学变化,及在神经发生与认知功能变化中发挥的作用。明确电离辐射旁效应在放射性认知障碍发生中的作用及机制,对降低颅脑肿瘤放疗后并发症的发生具有重要的现实意义。方法:本研究第一部分将接受X射线照射的肿瘤细胞与未受照的神经干细胞（NSC）共培养,采用流式细胞法检测NSC内活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）水平及NSC凋亡的变化;通过细胞计数方法,评估NSC的增殖情况;通过对神经球进行拍照后测量其直径来检测NSC成球能力的变化;通过免疫荧光实验检测NSC的干性维持能力及分化能力的变化。第二部分首先提取胶质瘤细胞分泌的外泌体,采用外泌体粒径测量观察细胞分泌外泌体的尺寸变化,采用荧光示踪方法观察外泌体进入细胞,从而确定旁效应因子的可能传递方式。进一步,分别将胶质瘤U251、GL261细胞接受照射后3 h分泌的外泌体加入NSC的培养液中,观察NSC的增殖及成球能力变化。本研究第三部分采用立体定位注射的方法,在小鼠海马区分别注射未受照GL261细胞分泌的外泌体和受照GL261细胞分泌的外泌体,以观察电离辐射旁效应因子是否在体内影响小鼠的神经发生及认知能力。采用Morris水迷宫检测小鼠认知能力的变化,通过小鼠脑组织的免疫荧光染色观察小鼠海马DG区新生神经元细胞的数量变化,从而探究电离辐射旁效应在放射性认知障碍中的贡献。结果:1.采用流式细胞术,发现受照胶质瘤细胞对与其共培养的NSC的凋亡无明显影响;受照胶质瘤细胞并未在与之共培养1 h后的NSC中诱导胞内氧化应激。2.通过共培养发现,与单独培养的NSC相比,与U251细胞共培养48 h后NSC的数量下降15.04%,而与10 Gy X射线照射的U251细胞共培养48 h后NSC的细胞数量下降25.83%;与单独培养的NSC相比,与未受照GL261细胞共培养48 h后NSC的数量下降11.08%,而与10 Gy X射线照射的GL261细胞共培养48 h后NSC的细胞数量下降14.16%;与单独培养的NSC相比,与未受照H460细胞共培养48 h后NSC的数量下降47.42%,而与5 Gy X射线照射的H460细胞共培养48 h后NSC的细胞数量下降了 55.17%。这些结果表明,肿瘤细胞本身就可通过培养基介导的机制抑制NSC的增殖,而受照肿瘤细胞会进一步增加其对NSC的这种抑制作用。3.共培养后拍照神经球并测量其直径发现,与单独培养的NSC相比,分别与U251、GL261和H460细胞共培养48 h后NSC的成球能力下降,表现为神经球直径变小;而分别与受照U251、GL261和H460细胞共培养48 h后NSC的成球能力下降更明显,神经球直径更小。4.采用免疫荧光实验发现,与单独培养的NSC相比,与U251细胞共培养后NSC的干维持性能力下降2.99%,而与10 Gy X射线照射的U251细胞共培养后NSC的干性维持能力下降14.23%;与GL261细胞共培养后NSC的干性维持能力下降12.78%,而与10 Gy X射线照射的GL261细胞共培养后NSC的干性维持能力下降28.07%。这表明与胶质瘤细胞共培养后NSC的干性维持能力下降,而胶质瘤细胞受照射可进一步增加其对NSC干性维持能力的抑制。5.采用免疫荧光染色的方法,发现与对照组NSC向神经元分化的阳性率相比,与U251细胞共培养后NSC的分化阳性率下降48.55%,与受照U251细胞共培养后NSC的分化阳性率下降73.08%;NSC与GL261细胞共培养时,与GL261细胞共培养后NSC的分化阳性率下降33.33%,与受照GL261细胞共培养后NSC的分化阳性率下降65.31%,这表明与胶质瘤细胞共培养后NSC向神经元分化的能力下降,而胶质瘤细胞受照射可进一步增加其对NSC分化能力的抑制。6.同样采用免疫荧光染色的方法,发现与对照组相比,与U251细胞共培养的NSC分化阳性率下降26.06%,与受照U251细胞共培养的NSC分化阳性率下降60.81%;同样与单独培养的NSC相比,与GL261细胞共培养的NSC分化阳性率下降6.21%,与受照GL261细胞共培养的NSC分化阳性率下降17.62%。以上结果表明与受照胶质瘤细胞共培养后NSC向胶质细胞分化的能力下降更明显。7.提取胶质瘤U251和GL261细胞分泌的外泌体,发现受照后细胞分泌的外泌体粒径下降。将外泌体加入NSC的培养液中培养2 h后发现,外泌体可进入NSC内。与不加外泌体的NSC相比,加入外泌体的两组NSC的增殖、成球能力都下降,且受照胶质瘤细胞分泌的外泌体显著降低NSC的增殖能力和成球能力。8.在小鼠海马区立体定位注射GL261细胞分泌的外泌体后,发现与注射PBS组的小鼠相比,注射0 Gy外泌体组的小鼠海马区新生细胞数量下降25.71%,新生神经元数量下降32.05%,小鼠认知能力下降,而注射10 Gy外泌体组的小鼠海马区新生细胞数量下降51.82%,新生神经元数量下降54.38%,小鼠认知能力下降更明显。结论:本研究证实接受X射线照射的胶质瘤细胞可通过培养液介导的旁效应影响神经干细胞,这种影响虽然并不会明显导致神经干细胞发生凋亡和胞内活性氧水平升高,但却显著抑制神经干细胞的增殖和成球能力,并且还显著降低神经干细胞的分化能力,表现为分化阳性率和分化细胞的完整程度均降低。进一步的研究证实,胶质瘤细胞分泌的外泌体可显著降低神经干细胞的增殖能力和成球能力。最后通过在体动物实验证实,受照胶质瘤细胞分泌的外泌体可导致小鼠海马区新生神经元细胞的数量下降和其认知能力显著降低。这些结果提示电离辐射旁效应可能对放射性认知障碍具有重要贡献。