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多种因素参与了哮喘气道炎症,包括各种抗原、炎症介质及细胞因子等。在气道炎症发生的同时伴有气道重塑(airway remodelling)的进行,因此,气道重塑是哮喘发生的早期病理变化之一。气道重塑包括气道上皮的增厚及脱落、上皮下胶原沉积、ASMC的增生肥大以及粘膜下血管的重新分布和塑形。其中ASMC的增生和肥大是参与气道重塑的主要因素之一。ASMC增生与支气管反应性增高及不可逆气流阻塞关系密切,抑制ASMC增殖对哮喘治疗有积极作用。 炎症介质及细胞因子对ASMC的刺激要经过不同途径的信号转导,将细胞外信号传递到细胞内,启动或抑制各种基因的表达,最终启动细胞周期。原癌基因是细胞内信号转导的最后共同通道,抑制原癌基因的表达可抑制ASMC的增殖与分化。 反义核酸可干扰基因产物的表达,是基因治疗的有效方法。已有研究表明反义c-myc寡核苷酸可抑制血管平滑肌、血管内皮及肝细胞增殖,抑制c-Myc及PCNA的表达。利用腺病毒载体将反义蛋白激酶-C导入ASMC可抑制细胞增殖。静脉注射反义IL-5寡核苷酸可抑制抗原诱导的气道嗜酸性粒 第四军医大学博士学位论文 细胞浸润,同时降低气道反应性。为观察反义C-p C对ASMC增殖的影响, 本研究如下: 一、反义C-刀wC寡核旮酸对大鼠ASMC增殖的影响 合成反义C-my C寡核昔酸,利用阳离子脂质体将反义C-以w寡核昔酸导 入大鼠ASMC,MTT法测定细胞生长,RTICR检测c-pc mRNA的表达, 免疫组织化学染色检测C-MyC的表达。结果表明反义C-m丁C寡核昔酸可抑制 大V’””增殖,且这种抑制作用可持续到反义c-mxc寡核昔酸作用后第六 天。反义C-川飞C寡核昔酸的这种抑制作用具有剂量依赖性,随剂量的增大, 抑制作用明显增强。反义c-mxc寡核昔酸可降低ASMC c-mxc mRNA的转录 并抑制 ASMC C-MyC蛋白的表达。 二、反义C-*C寡核旮酸抑制大鼠ASMC增殖与细胞凋亡的关系 将反义C-m吵C寡核昔酸导入大鼠ASMC,反义C-p C寡核昔酸可抑制大 鼠ASMC增殖,通过细胞染色观察凋亡小体的形成,流式细胞技术检测凋 亡峰的出现,细胞总DNA琼脂糖电泳检测凋亡特有电泳图谱,免疫组织化 学染色显示凋亡相关基因产物Bax及BclZ的表达。结果显示反义c-叮K寡 核昔酸导入大鼠ASMC后72 h无凋亡小体形成,流式细胞技术没有检测到 凋亡峰的出现,没有观察到典型的梯状凋亡图谱,免疫组织化学染色显示凋 亡相关基因产物Bax及Bcl2在各组表达无明显差异。反义c-m丁c寡核苦酸 抑制大鼠ASMC增殖与细胞凋亡无关。 三、反义C-刀wC真核表达载体的构建与大鼠ASMC增殖 克隆大鼠正义、反义C-my C片段,并构建大鼠反义及正义C-m吵C真核表 达载体,将所得载体导人大鼠ASMC,MTT法测定其对细胞生长的影响, 流式细胞技术观察反义及正义C-my C真核表达载体对细胞周期的影响,免疫 组织化学染色检测C-MyC的表达。结果显示反义C-p C真核表达载体可抑制 大鼠ASMC增殖,延长细胞S期并抑制C-MyC的表达。 四、反义C-*C重组腺病毒载体的构建与大鼠ASMC增殖 6 第四军医大学博士学位论文 构建大鼠反义及正义 C-m丁C细菌质粒,并将所得细菌质粒及腺病毒 EI缺夫质粒导入293细胞系,经共转染得到正义及反义重组腺病毒载体。MTT法检测重组腺病毒载体对大鼠ASMC增殖的抑制作用,免疫组织化学染色检测重组腺病毒载体对C-MyC蛋白的表达。结果显示反义C-m少C重组腺病毒载体可抑制大鼠ASMC增殖,抑制c-Myc的表达。