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桑树是一种重要的经济作物,并且我国拥有世界上最为丰富的桑树种质资源。但是许多病虫害和各种逆境条件往往会对桑树的产量造成重大影响。因此,研究桑树一些重要的功能基因及其在胁迫条件下的分子作用机制,可以增强桑树对各种胁迫条件的抗逆性,对提高桑叶产量和桑树种质资源的保存具有重要意义。然而,与其他作物相比,我们对桑树功能基因的研究至今还处于起步阶段,对桑树的一些功能基因及其编码的蛋白质的功能仍然不甚了解。因此,开展桑树功能基因的研究是一项紧迫而有意义的工作。 本文从已构建的桑树幼叶cDNA文库中获得了3个ESTs序列,并根据这三个已知的ESTs序列设计相关的特异性引物,结合 RT-PCR和RACE技术克隆得到了这3个基因的完整cDNA序列,并对获得的全长序列进行了结构分析和功能预测,利用胁迫诱导和半定量的方法对这3个功能基因进行了功能验证。本论文针对这3个基因所做的主要研究内容如下: 1、桑树甲硫氨酸亚砜还原酶基因的克隆、序列分析及诱导表达研究 从已构建的桑树幼叶 cDNA文库得到了一个编码桑树甲硫氨酸亚砜还原酶(methionine sulfoxide reductase)基因的一段序列,通过RT-PCR首次获得了这个基因的完整序列,并将其命名为M-MSR(GenBank登录号:JQ031782)。序列分析表明,该基因序列全长810bp,存在44bp的5’端非翻译序列(5’-UTR)和181bp的3’端非翻译序列(3’-UTR),其开放读码框(ORF)长585bp,编码194个氨基酸,预测蛋白质分子质量为21.60KD,等电点为6.78。同源分析表明,桑树M-MSR基因与杨树、草莓和蓖麻等各物种间具有很高的保守性。基于桑树和其它物种MSR基因的系统进化分析表明,桑树与草莓、葡萄、大豆、拟南芥的亲缘关系较近。半定量 RT-PCR检测表明, M-MSR在芽中表达量最高,在木质部和幼叶中表达量较低,说明M-MSR在桑树不同部位的表达存在一定的差异性。与正常生长环境相比,M-MSR基因 mRNA的转录水平在低温、干旱、高盐胁迫条件下均有所增加。该研究为今后转基因植物抗病工程方面打下了良好的基础。 2、桑树钙依赖性蛋白激酶基因的克隆、序列分析及诱导表达研究 从已构建的桑树幼叶 cDNA文库得到了一个编码桑树钙依赖性蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase)基因的一段序列,通过RACE(rapid-amplification of cDNA ends)与 RT-PCR结合的方法首次获得了这个基因的完整序列,并命名为M-CDPK(GenBank登录号:JQ066764)。序列分析表明,M-CDPK全长2249bp,包含381bp的5’端非翻译序列(5’-UTR)和269bp的3’端非翻译序列(3’-UTR),其开放阅读框(ORF)长1599bp,编码532个氨基酸,预测蛋白质分子质量为59.96KD,等电点为6.84。同源分析表明,桑树M-CDPK基因与烟草、陆地棉、草莓等各物种间具有很高的保守性。基于桑树和其它19个物种 CDPK基因的系统进化分析表明,桑树与拟南芥、拟南芥亚种、蓖麻、杨毛果的亲缘关系较近。半定量RT-PCR检测表明,幼芽表达量最高,在根和凋萎花中表达量较低,而在成熟果中几乎不表达,说明M-CDPK在桑树不同部位的表达存在一定的差异性。与正常生长环境相比,M-CDPK基因mRNA的转录水平在低温、盐胁迫条件下均有所下降,这可能是实验得到的只是CDPKs基因家族的一个基因,该基因所具有的特性还有待进一步研究。该研究为今后对桑树中CDPKs基因家族中相关基因的研究提供了一定的借鉴意义和参考价值。 3.桑树半乳糖激酶基因的克隆、序列分析和诱导表达 从已构建的桑树幼叶 cDNA文库得到了一个编码桑树半乳糖激酶(galactokinase)基因的一段序列,通过RT-PCR和RACE(rapid-amplification of cDNA ends)结合的方法首次获得了这个基因的完整序列,并命名为M-GALK(GenBank登录号:JQ041908)。序列分析表明,该基因全长1400bp,存在53bp的5’端非翻译序列(5’-UTR)和51bp的3’端非翻译序列(3’-UTR),其开放读码框(ORF)长1296bp,编码431个氨基酸,预测蛋白质分子质量为47.07KD,等电点为6.34。同源分析表明,桑树M-GALK基因与葡萄、拟南芥和云杉等各物种间具有很高的保守性。基于桑树和其它物种 M-GALK基因的系统进化分析表明,桑树与葡萄、蓖麻、杨毛果的亲缘关系较近。半定量RT-PCR检测表明,幼叶表达量最高,根和成熟果表达量较低,说明该基因在桑树不同部位的表达存在一定的差异性。与正常生长环境相比,M-GALK基因在低温和盐诱导的条件下,其表达量先减少而后明显增加。而在干旱和ABA诱导时,该基因表达量出现明显增加,之后表达量逐渐恢复。该研究表明M-GALK为胁迫性基因,将来可以为转基因植物的研究提供一定的借鉴价值,使其减少农作物在干旱、盐碱、低温等环境胁迫条件下生物产量的损失。