研究目的：人类多潜能干细胞(human pluripotent stem cells, hPSCs)主要包括人胚胎干细胞(human embryonic stem cells, hESCs)和人诱导性多潜能干细胞(human induced pluripotent stem cells, hiPSCs),二者兼具体外自我更新、无限增殖及多分化潜能的特性。它们的成功建株,极大地推动了干细胞基础研究和临床应用研究。研究的一个重要方向是将hPSCs向特定谱系的成熟血液细胞定向诱导分化。因为一直没有合适的研究人类早期造血发生的模型,以往的研究主要都是基于小鼠等动物模型。hESCs体外诱导分化红细胞的过程,模拟了人类胚胎期体内红系发生发育过程,为研究红细胞正常发育的调控机理奠定了实验基础。另一方面,利用患者hiPSCs体系建立体外诱导分化红细胞的方法,将为研究红细胞早期发育异常相关疾病的致病机理和开发个体化治疗手段提供理想的平台。在所有血细胞中,成熟红细胞因为不含细胞核,并携带着最小量的遗传物质,寿命较长等特点,有望作为最早的干细胞来源的细胞治疗产品而应用于临床。但在成功实现hPSC来源的红细胞临床应用前,还存在诸多问题需解决,例如：培养体系的不健全导致的体外扩增效率低、成熟程度低；脱核调控机制不明；没有合适的活体移植模型等。这些困难需要通过对hPSC来源红细胞的发生和成熟过程中的关键调控机理的理解来攻克。为了精密地研究hPSCs体外诱导分化红细胞的发育过程,在方法学上有两个亟待解决的问题。(1)现有实验数据已显示不同诱导体系产生的红细胞成熟程度有差异。这种差异指向一个事实,即成体造血微环境来源的基质细胞的诱导对hPSCs产生成熟红细胞是必需的。所以需要建立一套高效并趋于自然的共培养方法,以得到类似于自然发育过程产生的成熟红细胞。(2) hPSC来源的红细胞分化培养体系中,同时存在原始造血及成体造血过程,并且红细胞在早期发育存在不同的发育阶段。为了辨别不同的细胞,需要建立一种快捷、方便且准确的标识方法。在成体干细胞向红细胞分化发育过程的研究领域,已成功利用表型分子来区分红细胞的不同发育阶段,启示我们也可能利用表型分子来区分hPSC来源红细胞的早期不同发育阶段。研究方法：我们比较了不同的成体造血微环境来源的基质细胞,选择了小鼠主动脉-性腺-中肾(Aorta-Gonad-Mesonephros, AGM)细胞作为共培养体系的基质细胞。AGM区域是最早的支持成体造血的位点。我们建立了将hPSCs与AGM来源的细胞系AGM-S3体外向红细胞分化的培养方法。首先将hPSCs细胞与AGM-S3细胞系先共培养诱导造血分化的发生,再经悬浮培养向红细胞定向分化并扩增。以成体干细胞hCB-CD34~+来源的红细胞为对照,用先进的多色流式分析技术,探索hPSCs与AGM-S3共培养来源红细胞特异的表型分子表达谱系。随后以分别表达特异表型分子的红细胞亚群GPA~+CD36-和GPA~+CD34~+为切入点,利用荧光激活细胞分选(Fluorescence Activated Cell Sorting, FACS)技术,精确地将各目标细胞亚群分选出。然后利用瑞姬氏(May-Grunwald-Giemsa, MGG)染色方法观察细胞形态,通过免疫荧光染色方法考察血红蛋白组分来评价红细胞的成熟程度,并采用qRT-PCR技术检测造血及红细胞发育相关的重要基因的转录水平。研究结果：我们建立了高效的hPSC/AGM-S3共培养造血诱导分化体系,可以产生大量的高纯度和高成熟度红细胞,共培养12天再悬浮培养24天时,红细胞数量约为起始未分化H1细胞数量的300倍,其中85%以上表达成体型血红蛋白p。hPSC/AGM-S3共培养体系来源的红细胞p血红蛋白的表达率远远高于其他实验室报道的数据。我们在这个高效体系上进一步研究了hPSC/AGM-S3共培养体系来源红细胞发育过程的表型分子表达谱系,发现共培养阶段红系特有的表型分子GPA阳性(GPA~+)细胞上的其他共表达表型分子模式与已知的成体型红细胞的发育模式不同。其中GPA和成熟红细胞的特定分子CD36和造血干细胞的特有分子CD34的共表达均存在hPSCs分化发育的特有模式。我们根据这两条线索,进行了进一步细致地研究工作。本工作通过精密细致地研究,首次发现并论证了hPSC来源的早期红细胞可根据GPA和CD36抗原的共表达的表达变化指示不同的发育阶段。在共培养阶段相当长一段时间(6-18天)红细胞表型为GPA~+CD36-,悬浮培养后逐渐变为GPA~+CD36low/~+,10~+5天时达到一半左右,然后又再逐渐变为GPA~+CD36-。我们在不同时间点将CD36表达不同的红细胞亚群利用流式分选技术分离出来,通过对特定红细胞亚群Hb组分、表型分子及基因转录相对水平的比较,进一步揭示了这一系列的表型变化过程同时伴随着中胚层及内皮细胞特性的丢失,原始造血向成体造血特性的转变以及红细胞成熟度逐渐升高等变化过程。综合我们的实验数据,提示红细胞的初期发育是源于中胚层向内皮造血的途径,远在成体造血干／祖细胞被确定诞生之前。进一步的研究还发现hPSC/AGM-S3共培养阶段红细胞最初存在于表型为GPA~+CD34~+的细胞亚群中,细胞亚群比例先增加后减少。流式分选出共培养10天中的GPA~+CD34~+,对其细胞形态,人血红蛋白表达以及分化潜能进行了研究。现有数据显示GPA~+CD34~+是带有很强内皮细胞特性的细胞,约60%表达人Hb。我们拟进一步深入研究GPA~+CD34~+细胞与内皮细胞的关系,找出GPA~+CD34~+细胞的前体细胞,有望揭示hPSCs细胞来源最早红细胞的起源和发育过程。