卒中已经成为威胁人类健康的第一大长期致残因素及第二大致死因素。因此,对脑卒中的防治成为现代医学领域亟待解决的重大难题。对于出血性卒中,尚无有效的治疗药物。对于缺血性卒中,目前只有重组溶组织蛋白酶tPA能减轻神经损伤;但是由于其治疗时间窗短、副作用大、适用人群少等局限,极大的限制了其临床推广使用。基础研究证实,超过1000多种神经保护药物能减轻卒中后神经损伤,然而大样本的临床试验均以失败告终。这给本就艰难的脑卒中研究蒙上了巨大的阴影,有关卒中后脑损伤发生机制及干预措施的争论也愈趋激烈。大量的研究证实,缺血、高压氧等预处理措施可诱导内源性保护机制而发挥神经保护效应。与传统的抑制单一病理进程的干预方法相比,基于内源性保护机制的干预措施具有副作用小、效果持久、作用靶点多等优点。因此,Lancet、Nature Neuscience等杂志纷纷撰文,认为阐明内源性保护机制、开发基于内源性保护通路的干预措施将为我们治疗脑卒中提供新思路。然而,在我们前期的大样本研究中发现一个重要问题,预处理措施并不能使所有动物或患者从中受益。为什么相同的预处理措施会产生不同的效应?由于高压氧预处理的机制远未阐明,目前我们并不能合理解释这一现象。因此,寻找预处理措施的关键效应分子,阐明其作用机制,是高压氧预处理广泛应用于临床,进而进行基于内源性保护机制的药物开发必须解决的关键科学问题。另一方面,由于缺血性和出血性卒中的治疗措施截然不同,因此,临床上区分卒中的类型显得至关重要。然而,卒中类型区分,需要依赖于CT以及MRI(核磁共振)扫描结果,而这些影像学检查结果往往需要几十分钟,甚至数小时,这就错过了救治病人的黄金治疗时间。结合临床研究及动物实验深入分析发现,很多临床试验失败并不仅仅由于药物无效,更多的是在临床试验中,我们所给药物由于依赖CT及MRI等影像学检查而导致治疗延迟。因此,开发能够同时治疗缺血及出血性脑卒中的药物,在卒中症状出现早期即给予干预,成为未来治疗卒中的重要研究方向。因此,本课题一方面借助高通量蛋白质组学技术,筛选高压氧预处理诱导神经保护的效应分子,阐明其作用机制,并根据效应分子寻找基于内源性保护机制的治疗靶点。另一方面,通过文献回顾,寻找缺血及出血性卒中神经损伤过程中的共同信号通路,寻找治疗靶点,以期能够同时治疗缺血及出血性卒中。第一部分高压氧预处理诱导脑缺血耐受的效应分子筛选及机制研究实验一采用蛋白质组学方法筛选高压氧预处理诱导脑缺血耐受的效应分子【目的】1、筛选高压氧预处理脑保护作用的内源性效应分子。2、确定效应分子对脑缺血再灌注损伤的的神经保护作用。【方法】首先,采用核磁共振连续动态扫面的方法,检测高压氧预处理对脑缺血再灌注损伤大鼠脑保护效应的时效性。建立大鼠局灶性脑缺血再灌注(MCAO)模型,采用亚组分析方法,将高压氧预处理后的动物,通过术后脑梗死容积进行逆向分组,分为预处理有效组和预处理无效组。随后,采用同位素标记相对与绝对定量(iTRAQ)技术,进行差异蛋白筛选。采用Western Blot及ELISA技术,对筛选到的潜在效应分子进行逐一验证。为了进一步明确效应分子的神经保护效应,采用siRNA侧脑室微注射、基因敲除、给予外源性蛋白等方法进行验证。【结果】高压氧预处理对脑缺血再灌注损伤大鼠具有长期保护效应,能够明显改善缺血后28天的神经功能;核磁共振结果显示,在缺血损伤后28天,高压氧预处理组大鼠的脑梗死体积明显小于对照组。利用iTRAQ这一高通量蛋白质组学技术,我们筛选到了Cystatin C,Dkk3 protein,Platelet factor 4,Mannose-binding protein C(MBLC)等9种差异蛋白。采用ELISA及western-blot等方法,我们对这9种潜在效应分子的准确性进行了逐一验证。结果显示,Cystatin C及MBLC两种蛋白与筛选结果一致。高压氧有效组血清Cystatin C浓度显著高于对照组及无效组;有效组血清MBLC浓度显著低于对照组及无效组。相关性分析发现,血清中Cystatin C与脑损伤程度呈明显的负相关,而MBLC浓度与脑损伤程度呈明显的正相关。进一步研究显示,高压氧预处理后,脑组织中神经元及星形胶质细胞中Cystatin C的表达也显著升高。给予Cystatin C siRNA后,可部分逆转高压氧预处理诱导的脑保护效应。而在Cystatin C基因敲除的大鼠中,高压氧预处理的脑保护效应消失。同时,外源性Cystatin C对缺血性脑损伤有明显的治疗效应。【结论】本研究明确了高压氧预处理能够有效地减少细胞死亡,从而改善脑缺血再灌注损伤大鼠的长期预后,而不是延缓细胞死亡进程。通过蛋白质组学的高通量方法,我们筛选到Cystatin C是介导高压氧预处理诱导的机体内源性保护机制的关键效应分子。这一研究将为高压氧等非缺血预处理措施广泛应用于脑卒中的防治奠定科学基础,同时也为以Cystatin C为靶点,开发治疗缺血性脑卒中的药物提供了新思路。实验二Cystatin C通过保护溶酶体促进自噬介导高压氧预处理的神经保护效应【目的】确定高压氧预处理脑保护作用效应分子--Cystatin C的作用机制。【方法】建立大鼠局灶性脑缺血再灌注(MCAO)模型,检测缺血再灌注损伤后,Cystatin C在脑组织中表达的时程变化。并通过比较对照组和高压氧预处理组,Cystatin C在缺血损伤后的表达差异,明确高压氧预处理是否通过调控Cystatin C,影响缺血再灌注损伤的病理进程。同时,观察分析Cystatin C的表达与自噬小体相关蛋白表达的相关性,并借助Cystatin C的小干扰RNA调控Cystatin C的表达,探索Cystatin C与自噬相关蛋白的上下游关系。最后,采用免疫荧光、免疫电镜技术及Cystatin C基因敲除大鼠,观察溶酶体及自噬溶酶体的变化,明确高压氧预处理是否通过上调Cystatin C保护溶酶体,促进自噬顺利完成。【结果】缺血再灌注损伤后,半暗带皮质Cystatin C显著升高;而高压氧预处理可以使这一升高进一步加强。同时自噬小体相关蛋白的表达也于缺血损伤后增加,高压氧预处理可以促进缺血诱导的自噬小体相关蛋白上调。采用Cystatin C的小干扰RNA下调Cystatin C表达后,高压氧预处理促进自噬小体相关蛋白表达的效应消失。免疫荧光及免疫电镜的结果表明,高压氧预处理可以保护溶酶体的完整性,促进自噬小体与溶酶体融合,形成自噬溶酶体。而在Cystatin C基因敲除大鼠中,高压氧预处理保护溶酶体完整性及促进自噬溶酶体形成的效应被逆转。【结论】高压氧预处理通过同时增加自噬小体的形成,保护溶酶体的完整性,促进自噬小体与溶酶体融合,从而保障自噬的顺利进行,最终发挥其神经保护效应。作用机制的阐明,有助于高压氧预处理临床应用的推广。同时,实验一第一部分结果已经证明,外源性Cystatin C可以诱导与高压氧预处理相同的神经保护效应,丰富了Cystatin C的生物学功能,有望将其作为靶点,进行药物开发。第二部分缺血及出血性卒中共同信号通路治疗新靶点的发现及机制研究【目的】寻找缺血及出血性脑卒中的共同信号通路,并针对目标靶点,合成有效肽段,验证其神经保护作用及机制。【方法】通过文献回顾,我们发现MD2-TLR4是缺血性卒中及出血性卒中共同信号通路中的关键靶点之一。在体外研究中,通过原代神经元培养,用兴奋毒性损伤模型模拟卒中的病理过程;通过Western blot及免疫荧光技术,明确MD2在兴奋毒性损伤中的变化。根据MD2蛋白的生物学特性,分别合成能特异性干扰MD2功能及特异性降解MD2的短肽Tat-CIRP和Tat-CIRP-CMA。采用免疫共沉淀技术,验证合成肽段的生物学效应,并探索其对兴奋毒性损伤的保护作用。在体内研究中,通过构建局灶性缺血(MCAO)及颅内出血模型,验证MD2在这两种病理状态下的变化。通过神经功能学评分、TTC染色和尼氏染色等方法对肽段的短期及长期保护效应进行评估。最后,借助TLR4、MD2基因敲除小鼠,对MD2介导细胞死亡及Tat-CIRP诱导神经保护的分子机制进行探索。【结果】在培养的原代神经元中,NDMA诱导的兴奋毒性损伤,使MD2蛋白表达在受刺激后1小时后显著升高。根据MD2蛋白的生物学功能,合成的可以穿过血脑屏障及细胞膜,并能干预MD2功能的短肽Tat-CIRP、Tat-CIRP-CMA能有效阻断NMDA诱导的细胞死亡。此外,缺血再灌注损伤后,小鼠脑皮质半暗带MD2的表达于缺血再灌注损伤早期即明显升高,并于再灌注后6小时达到峰值;MD2的高表达可持续至缺血后24小时。同时,MD2表达的升高可以发生于神经元,而不仅仅局限于胶质细胞。在缺血损伤后3天及28天,Tat-CIRP能显著改善小鼠的神经功能,减少梗死体积。此外,出血性卒中也诱导MD2的表达升高,以MD2为干预靶点的Tat-CIRP,能显著改善出血性卒中小鼠的远期预后。机制研究表明,Tat-CIRP可以通过同时抑制凋亡及坏死性凋亡,从而产生保护效应。但在TLR4基因敲除小鼠的原代神经元中,MD2正常表达;在兴奋毒性损伤后,MD2依然显著上调;而给予以MD2为治疗靶点的Tat-CIRP进行干预,细胞死亡被逆转。在体实验结果也显示,与野生型小鼠相比,缺血再灌注损伤后,TLR4基因敲除小鼠的损伤程度减轻;而如果缺血后给予Tat-CIRP治疗,其损伤程度进一步减轻。【结论】MD2在中枢神经系统中,可以不依赖于传统的TLR4信号通路,在神经元中介导细胞死亡。以MD2为干预靶点而合成的短肽,Tat-CIRP能够显著减轻兴奋毒性损伤,改善缺血及出血性脑卒中的预后。因此,Tat-CIRP的应用可以不依赖于CT及MRI检查结果,可以在症状出现早期及院前急救中给予治疗,可以极大地提高救治成功率。在作用机制方法面,除了TLR4信号通路外,我们发现,MD2还通过别的信号通路介导细胞死亡,但具体机制还有待进一步阐明。