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第一部分PinX1基因调控端粒酶活性对鼻咽癌细胞自噬效应的影响目的:探究PinX1靶向端粒酶对鼻咽癌细胞自噬效应及增殖的影响。方法:通过qPCR和Western blot监测CNE2、6-10B细胞系中PinX1的表达。低表达细胞系转染PinX1过表达质粒及空载质粒并分组,RT-PCR监测各组hTERT mRNA表达,Western blot和免疫荧光监测自噬。CCK-8、transwell小室监测细胞增殖、迁移和侵袭能力,流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡。结果:1.PinX1在CNE2细胞中低表达,在6-10B细胞中高表达。2.CNE2细胞中导入PinX1过表达质粒后,hTERT表达降低。3.CNE2细胞中LC3Ⅰ、P62表达较高,LC3Ⅱ、Beclin1表达较低,自噬流形成较弱,自噬水平较低。细胞的增殖、侵袭迁徙能力较强。4.CNE2细胞中PinX1过表达后LC3Ⅰ、P62表达降低,LC3Ⅱ、Beclin1表达升高,自噬流形成增强,自噬水平增高。细胞的增殖、侵袭和迁徙能力均降低,细胞周期阻滞在G0/G1期,凋亡指数增加。结论:CNE2鼻咽癌细胞自噬表达较低,加入PinX1靶向端粒酶后,鼻咽癌细胞的自噬效应增强,增殖、迁徙和侵袭能力降低,凋亡增加。第二部分PinX1基因调控端粒酶介导鼻咽癌细胞自噬效应的分子机制研究目的:探究PinX1靶向端粒酶诱导鼻咽癌细胞自噬的分子机制。方法:在CNE2细胞中转染PinX1过表达质粒及空载质粒,并在PinX1过表达组加入3-MA。Western blot和免疫荧光监测自噬,CCK8、transwell小室监测细胞增殖、迁移和侵袭能力,流式细胞术分析凋亡情况,Western blot监测各组p65和p-p65的表达。在PinX1过表达组加入氯喹,分析各组p-AKT、p-mTOR的表达。结果:1.PinX1 过表达组加入 3-MA 后,LC3II、Beclin1 表达降低,LC3I、P62表达升高,自噬流形成减弱。细胞增殖、迁移和侵袭能力增强,凋亡指数降低。2.p65和p-p65在CNE2中高表达,PinX1过表达组低表达,加入3-MA后,其表达增高。3.p-AKT、p-mTOR在CNE2中升高,PinX1过表达组降低。加入氯喹后,p-AKT、p-mTOR表达无明显变化,自噬流形成减弱。结论:PinX1靶向端粒酶可能通过AKT/mTOR信号通路诱导鼻咽癌细胞发生自噬效应。此外,自噬效应的增强促进了鼻咽癌细胞凋亡,并通过NF-κB/P65发挥作用。第三部分PinX1靶向端粒酶对鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的影响目的:裸鼠成瘤实验监测PinX1对鼻咽癌细胞生长的影响。方法:将空白CNE2、转染空载质粒及PinX1过表达质粒的CNE2分别接种至三组裸鼠,并绘制瘤体的生长-时间曲线。剥离瘤体后行HE染色及免疫组化检测PinX1表达。结果:1.PinX1过表达组的裸鼠瘤体的生长受到了明显抑制。2.各组瘤体的HE切片细胞核均表现出异型性,免疫组化发现PinX1过表达组瘤体中PinX1的表达显著高于其他两组。结论:PinX1靶向端粒酶显著抑制了鼻咽癌裸鼠移植瘤的生长,为鼻咽癌的靶向治疗提供了理论基础。