二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,简称DHA)是一种重要的多不饱和脂肪酸,在大脑灰质、视网膜组织、神经系统及生殖系统有广泛分布,可促进婴幼儿大脑和视网膜发育,同时具有抗炎免疫、降血脂等重要作用。随着人们对DHA认识的加深,DHA市场需求的不断扩大,传统DHA来源深海鱼油已不能满足人们的需求。微生物发酵生产DHA以过程可控、产量稳定等优势逐步占据了市场,成为研究的热点。本文以裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)发酵生产DHA,不断优化发酵条件提高油脂及DHA产量,研究内容和结果如下:1、论文通过单因素实验考察了葡萄糖、酵母膏、玉米浆、海水晶、醋酸铵等营养物质用量及发酵液的pH和发酵时间对裂殖壶菌发酵生产油脂和DHA的影响。在单因素实验的基础上,论文通过正交实验优化发酵条件得到适宜的发酵条件为:葡萄糖70g/L、海水晶10g/L、pH=4、酵母膏6 g/L、醋酸铵0.5 g/L、玉米浆20 g/L、25℃、摇床(120rpm)培养8天。此时油脂及DHA产量较高,分别为9.2 g/L及4.28g/L。2、发酵液的pH对菌体的影响非常复杂,不仅影响菌体细胞膜的通透性,而且影响菌体内酶的活性,从而影响油脂和DHA的合成。论文考察了发酵液ph及调控方法对油脂和dha产量的影响。实验结果显示,适宜裂殖壶菌繁殖生长和油脂积累的ph是不同的,发酵液ph=5~7,有利于菌体的生长,ph=3~4有利于油脂和dha的积累。受菌体代谢的影响,发酵液的ph不断变化,论文采用调控ph的方法提高油脂和dha产量,适宜的ph调控方法为:裂殖壶菌发酵培养前四天,ph控制在3,随后ph调节到5,并保持两天,在该条件下总脂和dha的产量较大,分别为9.92g/l和4.14g/l。3、论文测定了裂殖壶菌在发酵过程中葡萄糖消耗曲线,根据葡萄糖消耗情况,确定两步法添加葡萄糖:初始发酵液中葡萄糖浓度为30g/l,第二天添加60g/l葡萄糖。在这种葡萄糖添加方式下,发酵前期,可避免过高的葡萄糖浓度对细胞生长的抑制作用,又能保证发酵后期碳源的供应,从而油脂及dha产量较高,可从葡萄糖一步法加入时的8g/l和3.51g/l分别提高到9.34g/l及3.74g/l。4、为了降低发酵成本,论文考察了用生物柴油副产物甘油替代葡萄糖的可行性。研究结果显示,甘油是一种适宜于裂殖壶菌发酵产油脂和dha的碳源;生物柴油副产物粗甘油可直接用于裂殖壶菌发酵,但发酵周期较长,油脂和dha产量略有降低;生物柴油副产粗甘油经活性炭吸附处理再用于裂殖壶菌发酵,可达到葡萄糖相同的效果,粗甘油用量为120g/l时,油脂及dha产量可达10.56g/l及4.24g/l。5、论文根据裂殖壶菌油脂积累机理,添加外源物质调控油脂的合成。考察了添加柠檬酸、苹果酸、磷酸二氢钠及其添加量对油脂合成和脂肪酸组成的影响。研究结果显示,当添加2g/L的柠檬酸时,油脂产量由8.44g/L提高到10.66g/L,DHA产量由3.05g/L增加到4.04g/L;当添加4g/L的苹果酸时,油脂产量由8.32g/L提高到10.35g/L,DHA产量由3.10g/L增加到3.76g/L;添加磷酸二氢钠对油脂积累和DHA生产没有显著影响,但会增加油脂中低碳脂肪酸的含量。6、论文用纤维素酶酶解破壁提油,比较了裂殖壶菌干粉和湿菌体酶解提油的效果,研究结果显示,酶解破壁提油的效果与酸解破壁提油的效果相近,酶法对比酸法可以降低能耗、减少污染。论文进一步研究了酶解产糖的工艺条件,在酶解pH为4.8,酶解温度54℃,酶解时间3小时,酶用量24g/(kg裂殖壶菌干粉)时,产糖量为9.9 g/(kg裂殖壶菌干粉)。论文将酶解液循环用于裂殖壶菌的发酵,对裂殖壶菌的细胞密度略有上升,油脂和DHA产量没有不利影响。