【摘 要】
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嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)是哺乳动物和水产动物重要的条件致病菌,具有一系列的毒力因子,包括溶血素、肠毒素、细胞毒素、甘油磷脂胆固醇酰基转移酶和丝氨酸蛋白酶等
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嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)是哺乳动物和水产动物重要的条件致病菌,具有一系列的毒力因子,包括溶血素、肠毒素、细胞毒素、甘油磷脂胆固醇酰基转移酶和丝氨酸蛋白酶等。有研究表明群体感应系统可以调控毒力因子的产生。
群体感应系统1(QS1)广泛存在于革兰阴性菌中,AhyI是嗜水气单胞菌QS1信号分子合成酶。本试验根据嗜水气单胞菌ATCC7966的ahyI基因序列设计并合成引物,以嗜水气单胞菌J-1株DNA为模板进行PCR的检测和分析,可扩增到952bp片段,通过Blast比对,发现与嗜水气单胞菌ATCC7966及嗜水气单胞菌SSU的ahyI基因同源性很高,分别为99%、96%。用PCR方法检测ahyI基因在115株不同来源、不同地区气单胞菌中的分布,结果表明22株嗜水气单胞菌中检出,阳性率为100%,且特异性高,说明ahyI基因在嗜水气单胞菌中有一定的保守性。维氏气单胞菌(A.veronii)ahyI基因的检出率为50%(34/68),在14株温和气单胞菌(A.sobria)和7株库蚊气单胞菌(A.culicicola)中分别有9株和3株为阳性。ahyI基因在健康、发病鱼以及水体中没有明显的特征分布。
根据嗜水气单胞菌ATCC7966的基因组设计两对引物,分别扩增嗜水气单胞菌J-1株ahyI基因的上游870bp和下游920bp,将氯霉素基因插入上下游之间,构建缺失ahyI基因的自杀性质粒pHM5(ahyI)。将重组的自杀性质粒转入EcoliSM10,用滤膜接合法将重组质粒转入嗜水气单胞菌J-1株,通过抗性以及蔗糖筛选出双交换的缺失株,并利用pUC18载体构建该基因的互补株。对缺失株、野生株及互补株的生物学特性进行分析,结果发现,hyI基因缺失后,菌株不能合成AI-1,但对AI-2的影响不显著。缺失株的胞外蛋白酶活性下降,通过SDS-PAGE比较发现,胞外蛋白图谱与J-1株明显不同;RT-PCR显示,丝氨酸蛋白酶基因表达降低。与J-1株相比,缺失株对Hep2细胞的黏附力和对EPC细胞的侵袭力都下降,但是在斑马鱼的半数致死量上与J-1株相同。
ahyI基因的敲除使嗜水气单胞菌无法合成信号分子AI-1,且胞外蛋白酶的活性、丝氨酸蛋白酶的表达、对Hep2细胞的黏附力以及对EPC细胞的侵袭力都受到不同程度的影响,但这些改变并没有对嗜水气单胞菌J-1的致病性产生明显影响。
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